植物固定生長,持續(xù)面對多種非生物脅迫,制約著植物的生長、發(fā)育和產(chǎn)量。月季（Rosa chinensis）為薔薇屬植物,是世界上重要的觀賞和園藝花卉。除了商業(yè)價值,還有一定的藥用價值。但是,非生物脅迫例如高溫、干旱等會嚴(yán)重影響月季的生長發(fā)育。高溫下,月季進(jìn)入休眠狀態(tài),不能開花,降低其觀賞價值。在全球“溫室效應(yīng)”日益明顯的今天,如何提高月季對高溫等非生物脅迫的抗性的研究將具有重要意義。為了從月季中克隆高溫脅迫相關(guān)的基因,本實(shí)驗(yàn)室將兩個耐熱性不同的月季品種,耐熱的“曼海姆宮殿”（SM）和不耐熱的“新十全”（KP）,在380C處理3h。處理前后取材,進(jìn)行雙向電泳。挑選了3個在熱激后的SM中高表達(dá)的蛋白,經(jīng)肽質(zhì)譜分析,初步推定這三個蛋白是熱激蛋白、真核轉(zhuǎn)錄起始因子5A和胚胎發(fā)育后期豐富蛋白（late embryogenesis abundant protein, LEA）。本文通過同源克隆、反式PCR、3’-RACE從月季中克隆到了LEA基因的開放閱讀框,序列比對發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆贒95/Lea14類LEA蛋白基因,命名為RcLEA。親水性分析顯示,RcLEA蛋白不是典型的高親水性LEA蛋白。亞細(xì)胞... 

【文章來源】：復(fù)旦大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：147 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 月季RcLEA基因的克隆和功能研究
    1 植物胚胎發(fā)育后期豐富蛋白的研究進(jìn)展和月季抗性研究現(xiàn)狀與意義
        1.1 植物胚胎發(fā)育后期豐富蛋白的研究進(jìn)展
            1.1.1 LEA蛋白的分類
            1.1.2 LEA蛋白的序列特征
            1.1.3 LEA蛋白的結(jié)構(gòu)
            1.1.4 LEA蛋白結(jié)合離子的特性和磷酸化
            1.1.5 LEA蛋白的表達(dá)模式和亞細(xì)胞定位
            1.1.6 LEA蛋白的功能
        1.2 月季的研究狀況及其抗性研究意義
            1.2.1 月季介紹
            1.2.2 月季抗性研究意義
            1.2.3 月季的研究狀況
        1.3 RcLEA的研究基礎(chǔ)
    研究技術(shù)路線
    2 材料與方法
        2.1 材料
            2.1.1 月季
            2.1.2 擬南芥
            2.1.3 煙草
            2.1.4 菌株和載體
            2.1.5 試劑和儀器
        2.2 方法
            2.2.1 月季RcLEA基因克隆
            2.2.2 RcLEA蛋白氨基酸序列比對和聚類分析
            2.2.3 月季RcLEA基因的高溫誘導(dǎo)表達(dá)模式
            2.2.4 過表達(dá)RcLEA基因大腸桿菌的脅迫評價
            2.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥綜合評價
            2.2.6 RcLEA原核表達(dá)和純化
            2.2.7 RcLEA對蛋白和酶活的保護(hù)
            2.2.8 亞細(xì)胞定位
            2.2.9 雙分子熒光互補(bǔ)（bimolecular fluorescence complementation,BiFC）實(shí)驗(yàn)
    3 結(jié)果與討論
        3.1 RcLEA的克隆和序列分析
        3.2 RcLEA的亞細(xì)胞定位
        3.3 RcLEA的表達(dá)在耐熱月季品種SM中受到高溫誘導(dǎo)
        3.4 在大腸桿菌中表達(dá)RcLEA能夠提高大腸桿菌對高低溫、鹽和氧化脅迫的耐受性
        3.5 擬南芥中過表達(dá)RcLEA增強(qiáng)了擬南芥對高溫的抗性
        3.6 擬南芥中過表達(dá)RcLEA增強(qiáng)了擬南芥對低溫的抗性
        3.7 擬南芥中過表達(dá)RcLEA對擬南芥的鹽脅迫、滲透脅迫的耐受性沒有影響
        3.8 在體外,RcLEA可以在多種脅迫下保護(hù)LDH的活性,防止CS聚合,維持大腸桿菌蛋白組的穩(wěn)定
        3.9 RcLEA自身能夠相互作用,以同源二聚體或寡聚體形式起作用
    4 小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
第二章 月季小分子熱激蛋白RcHsp17.8啟動子在擬南芥中的表達(dá)分析
    1 植物熱激蛋白研究現(xiàn)狀
        1.1 HSPs的分類和分子伴侶的功能
        1.2 植物sHSP的研究進(jìn)展
            1.2.1 sHSP的結(jié)構(gòu)與分子伴侶功能
            1.2.2 植物sHSP的分類和結(jié)構(gòu)特性
            1.2.3 植物sHSP的表達(dá)模式與功能
        1.3 植物sHSP的表達(dá)調(diào)控
        1.4 RcHsp17.8研究基礎(chǔ)與意義
    研究技術(shù)路線
    2 材料與方法
        2.1 材料
            2.1.1 擬南芥
            2.1.2 菌株和載體
            2.1.3 試劑和儀器
        2.2 方法
            2.2.1 RcHsp7.8啟動子序列分析
            2.2.2 載體構(gòu)建
            2.2.3 擬南芥轉(zhuǎn)基因及陽性植株篩選
            2.2.4 提取轉(zhuǎn)基因擬南芥DNA及PCR鑒定陽性植株
            2.2.5 RcHsp17.8全長啟動子在不同發(fā)育階段的不同組織中的熱激表達(dá)
            2.2.6 RcHsp17.8全長啟動子在不同脅迫下的表達(dá)
            2.2.7 RcHsp17.8啟動子缺失片段在高溫脅迫下的表達(dá)
            2.2.8 GUS染色
    3 結(jié)果與討論
        3.1 RcHsp17.8啟動子順式作用元件分析
        3.2 構(gòu)建表達(dá)載體
        3.3 不同發(fā)育階段不同組織中RcHsp17.8啟動子的表達(dá)
        3.4 RcHsp17.8啟動子對其他非生物脅迫的響應(yīng)
        3.5 RcHsp17.8啟動子的缺失分析
    4 小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
第三章 GIGANTEA參與非生物脅迫響應(yīng)的調(diào)控機(jī)理
    1 GIGANTEA（GI）功能的研究進(jìn)展
        1.1 GI與開花時間調(diào)控
        1.2 GI與生物鐘調(diào)控
        1.3 GI與非生物脅迫
        1.4 GI與脅迫下的開花
        1.5 Gl的其他功能
        1.6 GI與脅迫耐受性研究的意義
    研究技術(shù)路線
    2 材料與方法
        2.1 材料
            2.1.1 擬南芥
            2.1.2 菌株和載體
            2.1.3 試劑和儀器
        2.2 方法
            2.2.1 gi、wrky44突變體脅迫處理
            2.2.2 定量PCR檢測脅迫相關(guān)基因表達(dá)
            2.2.3 GI-GR誘導(dǎo)體系建立和應(yīng)用
            2.2.4 ChIP實(shí)驗(yàn)
            2.2.5 SOS1活性測定
    3 結(jié)果與討論
        3.1 gi-4突變體對多種非生物脅迫敏感且與光周期無關(guān)
        3.2 DGE數(shù)據(jù)分析
        3.3 脅迫相關(guān)基因在gi-4中的表達(dá)
        3.4 AtWRKY44可能是GI的直接下游基因
        3.5 WRKY44參與鹽脅迫響應(yīng)
        3.6 gi-4中SOSI活性下降
    4 小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
發(fā)表論文及專利申請
致謝



本文編號：2912798