為了建立一種豬薩佩羅病毒(Porcine sapelovirus,PSV)TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,試驗(yàn)根據(jù)GenBank中6株P(guān)SV的基因組序列設(shè)計(jì)合成特異性引物和探針,優(yōu)化擴(kuò)增體系和程序,并完成敏感性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)及PSV陽(yáng)性樣品的檢測(cè)。結(jié)果表明:優(yōu)化后的特異性引物和探針濃度均為0.8μmol/L、退火溫度為55℃;建立的PSV TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的最低檢測(cè)限為5×10～1拷貝/μL,TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的敏感性比普通PCR方法高100倍;僅以PSV陽(yáng)性質(zhì)粒為模板進(jìn)行的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)有擴(kuò)增曲線,其他對(duì)照病毒樣品均未發(fā)生擴(kuò)增;組間與組內(nèi)變異系數(shù)均低于1%;對(duì)30份陽(yáng)性病料進(jìn)行檢測(cè),擴(kuò)增結(jié)果均為陽(yáng)性。說(shuō)明試驗(yàn)建立的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法敏感性、特異性、重復(fù)性好,可用于PSV的臨床檢測(cè)。

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【部分圖文】：

圖1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果

2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,得到大小為143bp的目的片段(見(jiàn)圖1),與預(yù)期大小一致。經(jīng)測(cè)序比對(duì),PSV目的片段克隆成功。經(jīng)測(cè)定質(zhì)粒濃度為154.39ng/μL,根據(jù)公式計(jì)算質(zhì)�？截悢�(shù)為5.00×1010拷貝/μL,將質(zhì)粒于-20℃保存,作為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)按梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖2)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)=0.98,擴(kuò)增效率(E)=0.97,標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.395,截距為40.07,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系表達(dá)式為y=-3.395x+40.07。3.4敏感性試驗(yàn)

圖3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

目前檢測(cè)PSV的方法主要有病原學(xué)檢測(cè)、分子生物學(xué)鑒定。病原學(xué)檢測(cè)即是對(duì)病毒進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后通過(guò)電鏡觀察分析病毒粒子形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu),目前PSV的嗜性細(xì)胞有豬腎細(xì)胞(IBRS-2)、乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21)、豬腎貼壁細(xì)胞(LLC-PK)等[5-6],由于PSV對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)條件的要求較嚴(yán)苛....

圖4 特異性試驗(yàn)結(jié)果

圖3敏感性試驗(yàn)結(jié)果

本文編號(hào)：4047031