豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一種急性、高致病性腸道傳染病,主要危害哺乳仔豬。臨床表現(xiàn)為水樣腹瀉,嘔吐脫水等癥狀。哺乳仔豬通過(guò)乳汁中的母源抗體(分泌性IgA)獲得被動(dòng)免疫保護(hù)是較為有效的預(yù)防方式,檢測(cè)乳汁中的抗體對(duì)于防控PED具有重要意義。本研究從臨床檢測(cè)病料中分離到一株P(guān)EDV并進(jìn)行鑒定;在HEK-293懸浮細(xì)胞中表達(dá)了該毒株的N蛋白,以其為抗原分別建立了檢測(cè)PEDV血清IgG及乳汁IgA抗體的間接ELISA檢測(cè)方法,為PEDV的預(yù)防提供支持。相關(guān)研究結(jié)果如下:1.PEDV-JX18毒株的分離與鑒定2018年江西省某豬場(chǎng)送檢疑似感染PEDV的小腸組織,剪碎研磨并用細(xì)胞培養(yǎng)基過(guò)夜浸泡研磨組織獲得病毒液,通過(guò)Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒分離,在Vero細(xì)胞上盲傳至第五代時(shí)觀(guān)察到細(xì)胞病變,經(jīng)RT-PCR,IFA,透射電鏡及細(xì)胞超薄切片等方法鑒定,確定分離出一株田間的豬流行性腹瀉病毒,并命名為PEDV-JX18株。2.PEDV血清IgG間接ELISA方法的建...

【文章頁(yè)數(shù)】：58 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖2.1 PEDV細(xì)胞病變觀(guān)察

當(dāng)接種疑似感染組織浸出液的細(xì)胞盲傳至第五代時(shí),觀(guān)察到細(xì)胞病變(圖2.1),對(duì)照細(xì)胞呈現(xiàn)為典型的“鋪路石樣”,而對(duì)照細(xì)胞則明顯出現(xiàn)細(xì)胞病變,表現(xiàn)為細(xì)胞融合皺縮,成片脫落留下大片的空隙區(qū)。2.3.2RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

圖2.2 RT-PCR擴(kuò)增N基因的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

提取細(xì)胞培養(yǎng)物總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),擴(kuò)增得到大小約為701bp的目標(biāo)條帶(圖2.2)。結(jié)果顯示,與對(duì)照細(xì)胞產(chǎn)物相比出現(xiàn)特異性條帶,該特異性條帶經(jīng)基因序列測(cè)定證明分離的病毒為豬流行性腹瀉病毒,并將其命名為PEDV-JX....

圖2.3間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)Vero細(xì)胞內(nèi)的PEDV

Vero細(xì)胞接毒30h時(shí)細(xì)胞病變較為明顯,用4.0%多聚甲醛固定15min,0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫透化20min,按比例加入特異性PEDVN蛋白單克隆抗體進(jìn)行IFA。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照細(xì)胞相比,感染PEDV的Vero細(xì)胞上可觀(guān)察到特異性的紅色熒光,說(shuō)....

圖2.4 PEDV透射電鏡圖

收取接毒后細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基并進(jìn)行超速離心,30,000rpm/min,PBS重懸沉淀。經(jīng)過(guò)磷鎢酸鈉溶液負(fù)染后,透射電鏡下可觀(guān)察到形態(tài)完整的病毒粒子,其中心是電子不透明區(qū),周?chē)赡夷ぐ?囊膜上可看到短小的纖突。(圖2.4)。2.3.5細(xì)胞超薄切片檢測(cè)結(jié)果

本文編號(hào)：4053462