目的:構(gòu)建含有梅毒螺旋體(Treponema pallidum, Tp)外膜蛋白Tp 0319的優(yōu)勢(shì)表位區(qū)的原核表達(dá)載體pQE32/ Tp0319,并在E.coli M15中誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白,純化表達(dá)產(chǎn)物并對(duì)其進(jìn)行免疫原性和免疫反應(yīng)性分析,為探索Tp 0319重組蛋白在臨床梅毒血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值和其免疫活性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:通過生物信息學(xué)分析,挑選Tp0319基因優(yōu)勢(shì)抗原表位,以Tp Nichols株基因組DNA為模板,高保真聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增目的片段,將其克隆至原核表達(dá)載體pQE32中構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE32/ Tp0319,然后將其轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coli M15中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),利用SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行分析和鑒定表達(dá)產(chǎn)物;Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白,并進(jìn)行稀釋透析復(fù)性, BCA法測(cè)定純化蛋白濃度。用純化、復(fù)性的Tp0319重組蛋白包被微孔板,建立間接ELISA方法,檢測(cè)梅毒參比血清和臨床梅毒患者血清,同時(shí)與TPPA法進(jìn)行比較,根據(jù)重組蛋白與梅毒陰陽(yáng)性血清的反應(yīng)情況,評(píng)價(jià)重組抗原在梅毒血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)用純化的Tp0319重組蛋白免疫新西蘭兔,間接ELISA方法檢測(cè)免疫兔血清中Tp0319多克隆抗體的效價(jià),對(duì)Tp0319重組蛋白的免疫原性進(jìn)行分析。 結(jié)果:軟件分析Tp0319基因的抗原表位選擇了Tp0319基因的116-939bp位堿基序列為目的表位(片段長(zhǎng)度為824bp,編碼274個(gè)氨基酸);PCR擴(kuò)增得到大小約為824bp的目的片段;構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序鑒定證明其中插入片段為Tp0319目的基因,測(cè)序結(jié)果與Genbank上登錄序列完全一致;SDS-PAGE分析顯示,在IPTG誘導(dǎo)下,重組工程菌表達(dá)了一相對(duì)分子量(Mr)約為30kDa的目的蛋白條帶,目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)主要以包涵體形式存在;經(jīng)Ni-NTA親和純化獲得了純度在95%以上的重組蛋白;Western blot檢測(cè)其能與梅毒陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng);以重組蛋白為包被抗原建立間接ELISA法,檢測(cè)梅毒參考血清,其陰陽(yáng)性符合率均為100%;對(duì)TPPA法檢測(cè)的150份陰陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè),與TPPA法比較ELISA法的靈敏度為90.7%,特異度為100%,ELISA法與TPPA法符合率為95.3%;利用純化復(fù)性的Tp0319重組蛋白免疫新西蘭兔,間接ELISA法測(cè)定兔免疫血清特異性抗體效價(jià)在1:10 240以上。 結(jié)論: 1、成功構(gòu)建了pQE32/ Tp0319原核表達(dá)體,將其轉(zhuǎn)化至E.coli M15后表達(dá)出了一相對(duì)分子量(Mr)約30kDa的重組蛋白; 2、Tp0319重組蛋白具有良好的免疫原性,能刺激新西蘭兔產(chǎn)生高效價(jià)的特異性抗體; 3、Tp0319重組蛋白具有較好的免疫反應(yīng)性,能與梅毒陽(yáng)性血清特異性結(jié)合,有望應(yīng)用于梅毒血清學(xué)診斷。
【學(xué)位單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R759.1
【部分圖文】：

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圖 2 重組質(zhì)粒 pQE32 /Tp0319 雙酶切電泳圖apping of recombinant plasmid pQE32 /Tp031.ecombinant plasmid pQE32/Tp0319 digested w分析-BLAST 分析行確證，對(duì)該重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定， GenBank 上登陸的目的序列進(jìn)行比較 GenBank 登錄的序列號(hào)為 AE000520 的確。Treponema pallidum subsp. pallidum str. Nich

粒在 E.coli M15 中的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定2 /Tp0319重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli M15表達(dá)宿主菌中，進(jìn)行果顯示：誘導(dǎo)菌在 Mr約為 30kDa 處有一明顯條帶，與提高蛋白的表達(dá)量和純化需要，本研究從誘導(dǎo)溫度、I面進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化。PTG 誘導(dǎo)劑量對(duì) Tp0319 重組蛋白表達(dá)的影響2/Tp0319 重組表達(dá)體加入不同劑量 IPTG，采用相同的表達(dá)，SDS-PAGE 電泳結(jié)果表明，IPTG 的劑量對(duì)蛋白的影響，在 IPTG 濃度為 0.5mmol/L 時(shí)表達(dá)量最高（圖
【參考文獻(xiàn)】

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1 劉絢,石姜,王毅;檢測(cè)梅毒的幾種試驗(yàn)方法的對(duì)比評(píng)價(jià)[J];陜西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn);2001年02期

本文編號(hào)：2879772