巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis)屬于大戟科橡膠樹屬,是一種多年生熱帶喬木。天然橡膠的主要來源是從橡膠樹中產(chǎn)生的膠乳,具有十分重要的商業(yè)利用價值。前人已先后利用不同的分子標記技術(shù)構(gòu)建了巴西橡膠樹的多張遺傳圖譜,但是遺傳圖譜與染色體之間的關(guān)系尚不明確。將物理圖譜和遺傳圖譜整合,構(gòu)建分子細胞遺傳學(xué)圖譜,對于基因組序列的正確組裝,序列拼接具有重要意義。本研究以巴西橡膠樹熱研7-33-97品種為材料,利用熒光原位雜交與原位PCR技術(shù),選取Lespinasse等構(gòu)建的橡膠樹遺傳圖譜第6號和第16號連鎖群上的16個RFLP標記,將這些標記定位到巴西橡膠樹的染色體上,通過核型分析,從而確定這些標記在染色體的位置,以及連鎖群和染色體的對應(yīng)關(guān)系。研究結(jié)果如下:(1)來自第6號連鎖群上的13個遺傳標記被定位到了巴西橡膠樹熱研7-33-97的第3號染色體上,遺傳圖譜中連鎖群上遺傳標記排列順序和在染色體上的位置順序是一致的。其中 gHbCIR477、gHbCIR689.L1、gHbCIR140、gHbCIR207、gHbCIR 121、gHbCIR523.L1、gHbCIR150、gHbCIR 528這8個遺傳標記在3號染色體的短臂上,信號位點到著絲粒的百分距離依次為56.55、37.59、33.16、28.78、21.51、17.79、15.67和 4.63,而 gHbCIR475、gHbCIR129/489、gHbCIR647.L1、gHbCIR396、gHbCIR675這5個遺傳標記在3號染色體長臂上,信號位點到著絲粒的百分距離依次為28.02、30.96、51.04、53.69、66.34,著絲粒的位置在遺傳標記gHbCIR528與遺傳標記gHbCIR475 之間。(2)來自第16號連鎖群上的6個遺傳標記(gHbCIR421、gHbCIR588、gHbCIR647.L2、gHbCIR130、gHbCIR523.L2 和 gHbCIR689.L2)被定位到了巴西橡膠樹熱研7-33-97的第15號染色體上,并且遺傳圖譜中連鎖群上遺傳標記排列順序和在染色體上的位置順序是一致的。其中g(shù)HbCIR421、gHbCIR588、gHbCIR647.L2和gHbCIR130標記在15號染色體的短臂上,信號位點到著絲粒的百分距離依次為27.96、18.98、15.40 和 12.56,而 gHbCIR523.L2 和 gHbCIR689.L2 遺傳標記在 15 號染色體的長臂上,信號位點到著絲粒的百分距為43.13和60.50,著絲粒的位置在遺傳標記gHbCIR130與遺傳標記gHbCIR523.L2之間。(3)通過第6號和第16號連鎖群的定位結(jié)果,我們可以初步判定:Lespinasse等構(gòu)建的遺傳圖譜上第6號連鎖群與巴西橡膠樹熱研7-33-97的第3號染色體對應(yīng);第16號連鎖群與巴西橡膠樹熱研7-33-97的第15號染色體對應(yīng)。
【學(xué)位單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S794.1
【部分圖文】：

按照前述ＤＮＡ全基因組的提取方法，總共進行了?４個重復(fù)巴西橡膠樹７－３３－９７??基因組?ＤＮＡ?的提取，以？ｉ－Ｈｉｎｄｌｌｌ?ｄｉｇｅｓｔ（ＴａＫａＲａ）為參照、以?５叫與?２ｐＬ６ｘｌｏａｄｉｎｇ??ｂｕｆｆｅｒ混合進行凝膠電泳檢測，圖１中條帶單一清晰、無明顯拖尾與降解且分子量均??大于２３．１３ｋｂ說明提取的基因組ＤＮＡ完整。再進一步將提取的ＤＮＡ用紫外分光光度??計進行檢測，得到的濃度均為２００－４００ｎｇ／ｐＬ，?ＯＤ２６０／２８０的值均在１．６－１．８之間，說??明提取的ＤＮＡ濃度和純度都符合實驗所需要求。??１３０ｂｐ—??■??圖１熱研７－３３－９７品種葉片基因組ＤＮＡ的１０個重復(fù)圖??Ｆｉｇ．ｌ?Ｔｅｎ?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ?ｏｆ?Ｌｅａｖｅｓ?ｏｆ?７－３３－９７??３．２?１６個遺傳標記特異性序列擴增與序列比對結(jié)果??將設(shè)計的引物通過以提取的基因組ＤＮＡ為模板并按照ＰＣＲ反應(yīng)體系與條件（參照??２．２．３．２）進行ＰＣＲ擴增，經(jīng)擴增產(chǎn)物凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖２，目的產(chǎn)物為單一??條帶，且大小與設(shè)計引物時擴增目標片段一致。將擴增出的ＰＣＲ產(chǎn)物進行膠回收和試劑??盒純化，為了進一步驗證擴增的ＤＮＡ片段為我們所要的目的片段，將回收得到產(chǎn)物送由??上海英俊公司進行測序。將測序后的序列進行拼接，將拼接的序列與我們目的序列在??ＮＣＢＩ進行Ｂｌａｓｔ比對，比對結(jié)果見表５和附圖１－１６。，通過表５，擴增得到的ＰＣＲ與目??的序列的相似都均在９０％以上，比對結(jié)果吻合，說明擴增出的ＤＮＡ片段就是我們所要??的目的片段

Ｆｉｇ．２?Ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ｐｒｉｍｅｒｓ?ｗｅｒｅ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｎ?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｐｒｏｄｕｃｔｓ?ａｔ?Ｒｅｙａｎ?３－３３－９７??（圖中閱，１－１６分別對應(yīng)２００卜卩０１＼八１３（１（１６獷１＼１３１＾１＊（�。常保蓿蓿�、邑《＾（：１１＾４７７、廷１１１）＜：１１１１ｂＣＩＲ２０７、ｇＨｂＣＩＲ１２１、ｇＨｂＣＩＲ５２３．Ｌｌ／?ｇＨｂＣＩＲ５２３．Ｌ２?．?ｇＨｂＣＩＲ１５０、ｇＨｂＣＩＲ５２８ｂＣＩＲ４７５、ｇＨｂＣＩＲ１２９／４８９、ｇＨｂＣｌＲ３９６、ｇＨｂＣＩＲ６７５、ｇＨｂＣＩＲ６４７．Ｌｌ／?ｇＨｂＣＩＲ６４７．ＬｂＣＩＲ６８９．Ｌｌ／ｇＨｂＣＩＲ６８９．Ｌ２、ｇＨｂＣＩＲ５８８、ｇＨｂＣＩＲ４２１、ｇＨｂＣＩＲ１３０）??（Ｉｎ?ｔｈｅ?ｆｉｇｕｒｅ，Ｍ，?１－１６?ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ?２００ｂｐ?ＤＮＡ?ｌａｄｄｅｒ?Ｍａｋｅｒ?（Ｔａｋａｒａ）、ｇＨｂＣＩＲ４７ｂＣＩＲ１４０、ｇＨｂＣＩＲ２０７、ｇＨｂＣＩＲ１２１、ｇＨｂＣＩＲ５２３丄?１／?ｇＨｂＣＩＲ５２３．Ｌ２、ｇＨｂＣＩＲ１５０ｂＣＩＲ５２８、ｇＨｂＣＩＲ４７５、ｇＨｂＣＩＲｌ２９／４８９、ｇＨｂＣＩＲ３９６、ｇＨｂＣＩＲ６７５、ｇＨｂＣＩＲ６４７ｂＣＩＲ６４７．Ｌ２、?ｇＨｂＣＩＲ６８９．Ｌｌ／?ｇＨｂＣＩＲ６８９丄?２、?ｇＨｂＣＩＲ５８８、?ｇＨｂＣＩＲ４２１ｂＣＩＲ１３０ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）??表６測序序列與目的序列比對結(jié)果??Ｔａｂｌｅ?６?Ｃｏｍｐａｒｅ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ａｎｄ?ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ?ｓ

３．３．１?ｇＨｂＣＩＲ４７７遺傳標記的物理定位??用ｇＨｂＣＩＲ４７７的特異ＤＮＡ序列標記為ＤＩＧ標記的探針進行ＦＩＳＨ檢測分析，得??到如圖３的結(jié)果，通過圖３可知在染色體分裂的不同時期均能檢測到２個信號位點，??根據(jù)Ｓｏｎｇ?Ｙ等１９９５年報道的信號位點的百分距離的計算方法，結(jié)合高和瓊等（２００９）??的核型分析數(shù)據(jù)進行核型結(jié)合分析，得到圖３－Ａ５的核型圖。ｇＨｂＣＩＲ４４７遺傳標記位??于第３號染色體的短臂上，信號位點到著絲粒的百分距離為５６．５５：???ＨＵ??圖３?ＤＩＧ標記的ｇＨｂＣＩＲ４７７遺傳標記在巴西橡膠樹熱研７－３３－９７有絲分裂各個時期的鏡檢??圖（Ａ１：間期；Ａ２：前期；Ａ３：中期；Ａ４：陰性對照；Ａ５：中期細胞核型圖）??Ｆｉｇ．３?Ｇｅｎｅｔｉｃ?ｍａｒｋｅｒｓ?ｏｆ?ｇＨｂＣＩＲ４７７?ｍａｒｋｅｄ?ｂｙ?ＤＩＧ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ?ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｖａｒｉｏｕｓ??ｐｅｒｉｏｄｓ?ｏｆ?ｍｉｔｏｓｉｓ?ｏｆ?Ｒｅｙａｎ?７－３３－９７?ｏｆ?Ｈｅｖｅａ?ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ?（Ａｌ：Ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ?ｃｅｌｌ；?Ａ２：Ｐｒｏｍｅｔａｐｈａｓｅ?ｃｅｌｌ；??Ａ３：Ｍｅｔａｐｈａｓｅ?ｃｅｌｌ；Ａ４：?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ；?Ａ５：?ｋａｒｙｏｔｙｐｅ?ｏｆ?Ｍｅｔａｐｈａｓｅ?ｃｅｌｌ）??３．３．２?ｇＨｂＣＩＲ１４０遺傳標記的物理定位??用ｇＨｂＣＩＲ１４０的特異ＤＮＡ序列標記為ＤＩＧ標記的探針進行ＦＩＳＨ檢測分析，得??到如圖４的結(jié)果
【參考文獻】

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本文編號：2874017