中國水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)是石蒜科水仙屬植物,我國十大傳統(tǒng)名花之一。但中國水仙根為肉質須根,生長發(fā)育期需水量大,且可用于栽種水仙的良田大幅減少,因此,研究中國水仙應對干旱、鹽堿等逆境脅迫應答過程,對拓寬水仙用途,擴大其栽種地域具有重要意義。本研究主要分為三個部分:第一部分為'云香'水仙非生物脅迫相關WRKY基因的克隆;第二部分主要檢測'云香'水仙WRKY基因的組織特異性表達、時空特異性表達以及外源植物激素處理、非生物脅迫處理后的表達特征;第三部分為'云香'水仙WRKY基因過表達的轉基因煙草的抗旱和抗鹽能力初步分析。本研究結果為選育抗逆性的水仙新品種提供理論依據(jù)。主要研究結果如下:1.本研究基于課題組前期對'云香'水仙不同花期花瓣和副冠的轉錄組數(shù)據(jù)庫,利用RT-PCR技術克隆了NtWRKYY1(GenBank登錄號為 KX056495)和 NtWRKYY2(GenBank 登錄號為 KX056496)基因,對其進行初步的生物信息學分析。氨基酸基本理化性質分析表明NtWRKYY1蛋白為酸性且不穩(wěn)定的疏水性蛋白,NtWRKYY2蛋白為堿性且不穩(wěn)定的親水性蛋白。這2個蛋白為非分泌蛋白和非跨膜蛋白,以絲氨酸修飾為主導、蘇氨酸或酪氨酸為輔的磷酸化修飾方式。亞細胞定位預測表明這2個蛋白定位在細胞核的可能性較大。序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明NtWRKYY1基因屬于Ⅱc類WRKY轉錄因子,NtWRKYY2基因屬于Ⅱd類WRKY轉錄因子。2.實時熒光定量PCR結果表明NtWRKYY1和NtWRKYY2基因在'云香'水仙花中表達量顯著高于根和葉,具有明顯的組織特異性;時空表達分析結果表明在開花過程中的花瓣和副冠上NtWRKYY1和NtWRKYY2基因的轉錄水平基本呈現(xiàn)逐漸上升趨勢,推測NtWRKYY1和NtWRKYY2基因可能參與'云香'水仙花朵衰老的過程;外源生長調節(jié)物質處理'云香'水仙葉片后的表達特性表明NtWRKYY1基因的表達受ABA誘導和MeJA抑制,而NtWRKYY2基因的表達受ABA、MeJA誘導;非生物脅迫處理'云香'水仙葉片后的表達特性表明NtWRKYY1和NtWRKYY2基因的表達可能受高溫、干旱、鹽的誘導。3.利用In-Fusion克隆技術構建了 pMDC140-NtWRKYY1和pMDC140-NtWRKYY2過表達載體,采用農桿菌介導的葉盤法進行煙草的遺傳轉化,通過PCR和GUS染色鑒定證明WRKY基因已經導入煙草基因組中,分別獲得了轉NtWRKYY1基因煙草T0代陽性苗3株,轉NtWRKYY2基因煙草T0代陽性苗8株,收獲T0代陽性苗種子后播種獲得T1代陽性苗,對T1代轉基因植株進行干旱和鹽脅迫處理,結果顯示,NtWRKY11和NtWRKYY2過表達的轉基因煙草葉片萎蔫與黃化程度明顯小于野生型煙草,研究表明NtWRKYY1和NtWRKYY2基因過表達的轉基因煙草具有抵抗干旱和鹽脅迫的能力。該研究為水仙抗旱和抗鹽轉基因育種提供備選目的基因,為進一步篩選WRKY候選基因轉化水仙,以培育抗旱和抗鹽性強,適應性廣的中國水仙新品種奠定工作基礎。
【學位單位】：福建農林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2;S682.21
【部分圖文】：

３結果與分析??３．１?‘云香’水仙花瓣ＲＮＡ提取的質量??‘云香’水仙花瓣提取的ＲＮＡ，經瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示（圖２－１），??出現(xiàn)２８Ｓ、１８Ｓ兩條明顯的條帶，且２８ＳＲＮＡ亮度約為１８ＳＲＮＡ的２倍，整體??條帶清晰整齊，無ＤＮＡ污染，無拖尾彌散現(xiàn)象，這表明所提取的ＲＮＡ未發(fā)生??降解，具有較好的完整性。紫外分光光度計檢測，樣品ＲＮＡ的ＯＤ２６０ｍＷ２８０ｎｍ??介于１．８－２．０之間，ＯＤ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ均大于２．０，這表明所提取的ＲＮＡ無蛋白質、??其他有機物、其他小分子物質的污染

?葡恪??桑祝遙耍倩?虻目寺〖吧?鐨畔⒀Х治觶崳?３．２?‘云香’水仙ＭｔＳＴ基因的克隆與序列分析??ＰＣＲ結果（圖２－２）顯示，以‘云香’水仙盛花期花瓣ＲＮＡ逆轉錄成的??ｃＤＮＡ為模板，用特異引物進行ＰＣＲ反應，擴增得到的產物與預期基因片段大??小一致。測序結果表明，２條基因的開放閱讀框（ＯＲＦ）分別為５１０ｂｐ、８６７ｂｐ，??共編碼１６９、２８９個氨基酸，將２個基因依次命名為ＭＰｍｒｍ、??ＧｅｎＢａｎｋ?登錄號分別為?ＫＸ０５６４９５、ＫＸ０５６４９６。??Ｍ．?ＤＬ２０００；?ｌ．ＮｔＷＲＫＹＹｌ－，?２．ＭＷＲＫＹＹ２；??圖２－２?‘云香’水仙ＮｔＷＲＫＹＹ?１、ＮｔＷＲＫＹＹ２基因的克隆??Ｆｉｇ．?２－２?Ｃｌｏｎｉｎｇ?ｏｆ?ＮｔＷＲＫＹＹｌ?？ｉｎｄＮｔＷＲＫＹＹ２?ｇｅｎｅｓ?ｆｒｏｍ?Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ?ｔａｚｅｔｔａ?ｖａｒ．?＇Ｙｕｎｘｉａｎｇ５??３．３?‘云香’水仙ＷＲＫＹ轉錄因子的蛋白結構分析??３．３．１氨基酸基本理化性質分析??氨基酸基本理化性質分析結果表明（表２－７），ＮｔＷＲＫＹＹｌ蛋白和??ＮｔＷＲＫＹＹ２蛋白的氨基酸數(shù)、相對分子質量、等電點、分子式、不穩(wěn)定系數(shù)以??及疏水性均各不相同，說明這２個蛋白可能具有不同的功能。ＮｔＷＲＫＹＹｌ蛋白??的等電點小于７．００，不穩(wěn)定系數(shù)大于４０，疏水性為正值，說明該蛋白為酸性且??不穩(wěn)定的疏水性蛋白。ＮｔＷＲＫＹＹ２蛋白的等電點大于７．００

第二章‘云香’水仙ＷＲＫＹ基因的克隆及生物信息學分析??ＷＲＫＹＧＱＫ基序，Ｃ端鋅指結構域為Ｃｘ４Ｃｘ２３ＨｘＨ型，是ＩＩ類ＷＲＫＹ轉錄因子。??利用ＭＥＧＡ５．２軟件構建了ＮｔＷＲＫＹＹｌ與擬南芥中＾類ＷＲＫＹ轉錄因子的蛋??白系統(tǒng)進化樹，結果顯示（圖２－８）?ＮｔＷＲＫＹＹｌ與ＡｔＷＲＫＹ５７聚在一起，進一??步說明基因屬于ＩＩ?ｃ類ｗｒｋｙ轉錄因子。??
【參考文獻】

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本文編號：2893704