發(fā)布時間：2017-12-11 01:04

  本文關(guān)鍵詞：褪黑素和CNP對綿羊卵母細胞體外成熟的影響及過表達AANAT的研究

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【摘要】：卵母細胞體外成熟(IVM)是胚胎工程研究的重要基礎(chǔ)環(huán)節(jié),但體外成熟卵母細胞的質(zhì)量與體內(nèi)相比仍有很大差異。大量的研究表明褪黑素(MT)和C-型鈉鈦(CNP)在動物的生殖活動尤其是對卵母細胞的成熟發(fā)育具有重要的意義。因此本研究利用MT和CNP對綿羊卵母細胞進行體外成熟培養(yǎng),以期進一步完善體外培養(yǎng)體系并研究卵母細胞體外成熟的調(diào)控機理,從而為綿羊的體外受精、核移植等生物技術(shù)的開展奠定基礎(chǔ)。實驗一研究了褪黑素對綿羊卵母細胞體外成熟的影響。免疫熒光檢測表明在綿羊GV和MII卵丘顆粒細胞、卵母細胞上都表達褪黑素受體MT1和MT2,western blot檢測表明MT1和MT2在壁顆粒細胞、GV和MII卵丘顆粒細胞及卵母細胞上都表達,且MT1在顆粒細胞和GV卵丘顆粒細胞上的表達顯著高于GV卵母細胞、MII卵母細胞和卵丘顆粒細胞;MT2在MII卵母細胞上的表達顯著高于GV顆粒細胞、卵丘顆粒細胞和卵母細胞及MII卵丘顆粒細胞;成熟液中添加10-9～10-7 mol/L褪黑素顯著提高卵丘顆粒細胞擴展和極體排出率,且10-7 mol/L顯著提高了卵裂率和囊胚率;RT-PCR結(jié)果表明10-7mol/L褪黑素對卵母細胞GDF9、DNMT1的表達沒有影響但提高了卵母細胞上BMP15及卵丘顆粒細胞PTX3、HAS2、EGFR的表達;添加抑制劑Luzindole組極體排出率、孤雌激活后的卵裂率、囊胚率和孵化囊胚率與對照組相比沒有差異,但顯著低于MT組;MT顯著降低卵母細胞的cAMP、增加顆粒細胞的cGMP。本研究結(jié)果說明MT主要是通過MT1受體發(fā)揮作用的。實驗二研究了 CNP對綿羊卵母細胞減數(shù)分裂的影響。RT-PCR檢測表明在綿羊壁層顆粒細胞、GV卵丘顆粒細胞和卵母細胞上CNP和NPR2都有表達,且壁層顆粒細胞上CNP含量顯著高于卵母細胞和卵丘顆粒細胞,而卵丘顆粒細胞上NPR2顯著高于壁層顆粒細胞和卵母細胞。在成熟培養(yǎng)液中添加200 nM CNP處理不同時間(4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h)的結(jié)果表明:CNP處理4 h內(nèi)能顯著抑制核成熟,6 h后抑制作用迅速降低,CNP處理16 h已有卵丘顆粒細胞完全擴展,說明CNP處理最佳時間是4 h且對卵丘顆粒細胞擴展沒有影響。CNP處理綿羊COCs 4 h、8 h、12 h卵母細胞和卵丘顆粒細胞上相關(guān)基因的表達變化表明:卵母細胞上CNP、NP和MT18 h表達量最高,卵丘顆粒細胞上NPR2 4 h表達量最高,FSHR、LHR、MT1、MT2、EGFR總體呈上升趨勢,說明卵母細胞發(fā)生GVBD需要CNP的參與,CNP能夠促進成熟相關(guān)基因的表達。200 nM CNP處理共培養(yǎng)綿羊壁層顆粒細胞(MGC)和COCs 4 h、8 h、12 h結(jié)果表明:GC細胞上CNP、NPR2、MT1、MT2和LHR的表達量呈上升趨勢,說明GC分泌CNP,同時促進了 GC上NMT1、LHR的表達;COCs上CNP也增加,主要可能是由于GC合成的CNP進入COCs,而COCs上NPR2在4 h表達量最高,充分說明了壁層顆粒細胞分泌CNP并通過卵丘顆粒細胞上NPR2發(fā)揮作用。本研究結(jié)果揭示了 CNP在4 h內(nèi)能夠抑制卵母細胞的減數(shù)分裂恢復(fù),且不影響COCs的卵丘顆粒細胞擴展,其作用機制是通過壁層顆粒細胞分泌CNP作用于卵丘顆粒細胞上的NPR2受體,從而影響了卵母細胞和卵丘顆粒細胞上相關(guān)基因的表達,進一步影響COCs的體外成熟。實驗三研究了 CNP和MT共同處理對綿羊卵母細胞體外成熟及孤雌激活胚胎體外發(fā)育的影響。實驗結(jié)果表明,CNP預(yù)處理4 h再繼續(xù)成熟24 h和28 h組孤雌激活胚的卵裂率顯著高于對照組,再成熟24 h組囊胚率顯著高于對照組,而再成熟28 h組囊胚率和對照組沒有顯著差異。研究結(jié)果還表明CNP、MT單獨或聯(lián)合使用胚胎的卵裂率、囊胚率和囊胚細胞數(shù)都顯著高于對照組;定量PCR結(jié)果表明,CNP、MT、CNP + MT三組CNP、NPR2、FSHR和EGFR都顯著提高;CNP、MT、CNP + MT三組線粒體均勻分布比例顯著提高,皮質(zhì)顆粒完全遷移的比例顯著提高。綜上所述,利用CNP、MT進行綿羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)都能夠促進胞質(zhì)與核成熟的同步性,增加成熟相關(guān)細胞因子的分泌,從而顯著提高卵母細胞體外成熟的質(zhì)量,從而提高胚胎的發(fā)育能力。實驗四研究了過表達AANAT基因?qū)�轉(zhuǎn)基因綿羊生產(chǎn)效率的影響。研究結(jié)果表明OPS冷凍胚胎的產(chǎn)仔率、羔羊存活率和轉(zhuǎn)基因陽性率與未冷凍胚胎沒有顯著性差異,但冷凍胚胎的后代平均初生重高于未冷凍胚胎,轉(zhuǎn)AANAT陽性后代的超排效率和后代擴繁效率與對照組差異不顯著,但顯著高于陰性組,后代擴繁的窩產(chǎn)羔數(shù)顯著高于對照組和陰性組,但擴繁后代初生重低于對照組。以上結(jié)果揭示了原核注射AANAT基因的胚胎過表達AANAT基因,提高了胚胎的褪黑素水平和后代卵母細胞的質(zhì)量,進而提高了胚胎移植效率、轉(zhuǎn)基因陽性率和后代的繁殖效率。綜上所述,MT能夠促進綿羊卵母細胞的體外成熟及孤雌胚胎的體外發(fā)育;CNP在4 h內(nèi)能夠顯著抑制卵母細胞的減數(shù)分裂恢復(fù);CNP、MT單獨或者聯(lián)合使用,都有利于卵母細胞的體外成熟,提高CNP、NPR2、FSHR、LHR、EGFR、MT1和MT2基因的表達及線粒體均勻分布和皮質(zhì)顆粒完全遷移的比例;顯微注射轉(zhuǎn)入AANAT基因提高了胚胎的褪黑素水平,提高胚胎移植的效率和轉(zhuǎn)基因后代的陽性率及轉(zhuǎn)基因后代的繁殖效率。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S826

【參考文獻】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張玲;BDNF對小鼠未成熟卵母細胞的作用及機制研究[D];華中科技大學(xué);2009年

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本文編號：1276557