發(fā)布時(shí)間：2020-10-11 16:46

　　 牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是造成豬、牛、羊和鹿等家畜動(dòng)物和部分野生動(dòng)物的牛病毒性腹瀉-黏膜病(bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD)的主要病原體。該病毒在全球范圍內(nèi)廣泛傳播,對(duì)畜牧業(yè)的健康發(fā)展和牛源生物制品(血清和凍精等)質(zhì)量提高等造成巨大的威脅。但是,目前我國尚無有效的藥物和防控措施抵御BVDV感染,其主要原因之一是BVDV持續(xù)性感染的分子機(jī)制尚未系統(tǒng)闡明。而大量的研究表明細(xì)胞自噬和凋亡等信號(hào)通路直接影響病毒持續(xù)性感染,而且microRNA(mi RNA)也能通過調(diào)控細(xì)胞自噬和凋亡等信號(hào)通路進(jìn)而影響病毒持續(xù)性感染,所以本研究全面探索BVDV、miRNA、自噬和凋亡之間相互作用的分子機(jī)制,為闡明BVDV持續(xù)性感染的分子機(jī)制提供理論依據(jù);同時(shí)通過定點(diǎn)突變和反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建BVDV定點(diǎn)突變株,為研發(fā)抗BVDV有效方法奠定了技術(shù)和理論支持,也為家畜的抗病育種工作提供新的方法和理論依據(jù)。目的:本研究以BVDV標(biāo)準(zhǔn)株NADL為研究對(duì)象,探索BVDV NADL調(diào)控宿主細(xì)胞MDBK的細(xì)胞自噬和凋亡通路及自噬改變對(duì)BVDV NADL復(fù)制影響的分子機(jī)制,并探索利用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建定點(diǎn)突變性BVDV毒株。(1)探索BVDV NADL影響MDBK細(xì)胞自噬的分子機(jī)制;(2)探討MDBK細(xì)胞自噬水平改變后對(duì)BVDV復(fù)制的影響;(3)探究miR-29b對(duì)BVDV NADL感染誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬及BVDV NADL復(fù)制的影響;(4)分析miR-29b對(duì)MDBK細(xì)胞凋亡的影響;(5)使用反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救定點(diǎn)突變型BVDV毒株。通過本研究的開展,為系統(tǒng)闡述BVDV持續(xù)性感染的分子機(jī)制、開發(fā)防控BVDV的新方法和家畜的抗病育種工作奠定理論依據(jù)。方法:(1)BVDV NADL感染GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MDBK細(xì)胞,在處理后不同時(shí)間,采用實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot、激光共聚焦顯微鏡和透射電鏡等方法檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平和自噬活性變化;并構(gòu)建紅色熒光標(biāo)記的BVDV NADL三個(gè)糖蛋白Erns、E1和E2基因過表達(dá)的慢病毒,使用相同方法檢測(cè)糖蛋白過表達(dá)對(duì)細(xì)胞自噬活性的影響;(2)使用自噬抑制劑、促進(jìn)劑和RNA干擾技術(shù)分別處理MDBK細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞自噬水平的變化;并使用BVDV NADL感染自噬活性改變的MDBK細(xì)胞,檢測(cè)BVDV NADL mRNA水平變化;(3)預(yù)測(cè)并鑒定miR-29b在自噬信號(hào)通路中靶基因ATG14和ATG9A;檢測(cè)pre-miR-29b過表達(dá)的慢病毒和BVDV NADL感染后靶蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞自噬水平及BVDV NADL復(fù)制水平;并設(shè)計(jì)ATG14和ATG9A回補(bǔ)實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步驗(yàn)證miR-29b通過下調(diào)靶蛋白ATG14和ATG9A的表達(dá),進(jìn)而影響B(tài)VDV NADL感染誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平和BVDV的復(fù)制;(4)預(yù)測(cè)和鑒定miR-29b在凋亡信號(hào)通路中的靶基因NAIF1和caspase-7;檢測(cè)miR-29b模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染后MDBK細(xì)胞凋亡水平及caspase-7和NAIF1 mRNA和蛋白表達(dá)水平;并設(shè)計(jì)caspase-7和NAIF1回補(bǔ)實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步證明miR-29b通過下調(diào)caspase-7和NAIF1的表達(dá),進(jìn)而影響凋亡水平;(5)構(gòu)建T7 RNA聚合酶基因過表達(dá)的慢病毒,并感染MDBK細(xì)胞;使用嘌呤霉素進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)篩選;檢測(cè)T7RNAP表達(dá)水平和T7 RNA聚合酶活性;傳至40代,鑒定MDBK-T7RNAP細(xì)胞的穩(wěn)定性;并以pACNR/NADL質(zhì)粒為模板,使用定點(diǎn)突變?cè)噭┖型蛔僂2和NS4B基因位點(diǎn);轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒至MDBK-T7RNAP細(xì)胞中,拯救定點(diǎn)突變株,并檢測(cè)BVDV定點(diǎn)突變株復(fù)制水平的變化;并傳代鑒定其遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果:(1)BVDV NADL感染及Erns和E2過表達(dá)都能顯著性增加自噬體/自噬溶酶體的數(shù)量、GFP-LC3 puncta數(shù)量、Beclin1和ATG14 mRNA和蛋白水平;(2)3-MA、渥曼青霉素和RNA干擾能抑制細(xì)胞自噬活性和BVDV NADL的復(fù)制;相反地,rapamycin處理能顯著性促進(jìn)細(xì)胞自噬和增加BVDV NADL復(fù)制;當(dāng)BVDV NADL感染18 h后,5’UTR轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)降低,加入溶酶體抑制劑氯喹,其轉(zhuǎn)錄水平又出現(xiàn)升高;(3)miR-29b能特異性靶向ATG14和ATG9A的3’UTR區(qū)并抑制其表達(dá);同時(shí)miR-29b高表達(dá)能顯著性降低BVDV NADL的復(fù)制水平及其感染誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬;ATG14和ATG9A表達(dá)回復(fù)后,BVDV NADL復(fù)制水平和BVDV NADL感染誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平又出現(xiàn)升高;(4)miR-29b降低了MDBK細(xì)胞凋亡水平;miR-29b能直接靶向NAIF1和caspase-7 3’UTR并抑制其表達(dá);NAIF1和caspase-7過表達(dá)后顯著性增加細(xì)胞凋亡水平;(5)成功篩選獲得具有較強(qiáng)的T7 RNA聚合酶活性和較好穩(wěn)定性的MDBK-T7RNAP細(xì)胞;并成功構(gòu)建E2和NS4B突變的BVDV毒株BVDV E2M和NS4BM;與親本株相比,BVDV E2M和NS4BM mRNA復(fù)制水能力和增殖能力有所下降。結(jié)論:(1)BVDV NADL感染及Erns和E2過表達(dá)能顯著性增加細(xì)胞自噬的活性,首次闡明BVDV感染對(duì)自噬的影響及其分子機(jī)制;(2)細(xì)胞自噬水平下降后阻止了BVDV NADL復(fù)制;早期自噬水平上調(diào)后增加了BVDV NADL的復(fù)制;闡述了自噬改變對(duì)BVDV復(fù)制的影響,也進(jìn)一步為闡明BVDV持續(xù)性感染的分子機(jī)制奠定理論依據(jù);(3)miR-29b直接靶向自噬相關(guān)蛋白ATG14和ATG9A并抑制其表達(dá),進(jìn)而抑制BVDV NADL感染誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和BVDV NADL復(fù)制,闡明了miR-29b通過影響自噬進(jìn)而影響B(tài)VDV復(fù)制的分子機(jī)制;(4)miR-29b直接靶向凋亡相關(guān)蛋白caspase-7和NAIF1并抑制其表達(dá),進(jìn)而降低MDBK細(xì)胞凋亡水平,闡明miR-29b影響細(xì)胞凋亡和BVDV復(fù)制的分子機(jī)制;(5)成功拯救生長能力有所降低和遺傳穩(wěn)定性好的BVDV點(diǎn)突變株E2M和NS4BM,為建立有效的BVDV定點(diǎn)突變型疫苗候選株提供了技術(shù)支持。
【學(xué)位單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S852.65
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
引言
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    綜述一 牛病毒性腹瀉病毒的分子生物學(xué)特征
        1 BVDV概況
            1.1 BVD流行病學(xué)
            1.2 BVDV生物多樣性
        2 BVDV基因組特性
            2.1 非編碼區(qū)域
            2.2 結(jié)構(gòu)蛋白
            2.3 非結(jié)構(gòu)蛋白
        3 BVDV的持續(xù)性感染
            3.1 持續(xù)性感染的特征
            3.2 持續(xù)性感染的發(fā)生機(jī)制
            3.3 BVDV持續(xù)性感染的研究進(jìn)展
        4 小結(jié)與展望
    綜述二 細(xì)胞自噬與病原體感染
        1 自噬概況
            1.1 自噬的起源
            1.2 自噬的定義
            1.3 自噬的類型
            1.4 自噬相關(guān)蛋白
        2 自噬體發(fā)生的分子機(jī)制
        3 自噬的檢測(cè)技術(shù)和研究方法
            3.1 自噬的檢測(cè)技術(shù)
            3.2 自噬抑制劑和促進(jìn)劑
                3.2.1 自噬抑制劑
                3.2.2 自噬促進(jìn)劑
        4 自噬影響病原體感染
            4.1 自噬促進(jìn)宿主細(xì)胞對(duì)病原體的清除
            4.2 自噬促進(jìn)胞內(nèi)病原體的增殖
        5 自噬與黃病毒科病毒感染
            5.1 自噬與黃病毒屬病毒
            5.2 自噬與瘟病毒屬病毒
            5.3 自噬與肝炎病毒屬病毒
        6 小結(jié)與展望
    綜述三microRNA調(diào)控病毒復(fù)制
        1 miRNA概述
            1.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)
            1.2 miRNA的生物起源
            1.3 miRNA作用機(jī)制
            1.4 miRNA主要研究方法
        2 miRNA與病毒
            2.1 宿主miRNA在病毒感染過程中的調(diào)節(jié)作用
            2.2 病毒編碼miRNA調(diào)控病毒的復(fù)制
        3 小結(jié)與展望
第二部分 實(shí)驗(yàn)研究
    實(shí)驗(yàn)一 BVDV NADL影響細(xì)胞自噬水平的研究
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 結(jié)果
            2.1 正常和病毒感染的MDBK細(xì)胞形態(tài)觀察
            2.2 GFP-LC3轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞情況
            2.3 透射電鏡觀察自噬體和自噬溶酶體結(jié)構(gòu)
            2.4 熒光倒置顯微鏡觀察GFP-LC3 puncta陽性細(xì)胞
            2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察自噬溶酶體的形成
            2.6 自噬相關(guān)蛋白Beclin1和ATG14 mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)
            2.7 自噬相關(guān)蛋白Beclin1和ATG14蛋白表達(dá)水平檢測(cè)
            2.8 紅色熒光蛋白標(biāo)記的慢病毒過表達(dá)載體pLEX-Td-tomato的構(gòu)建
            2.9 過表達(dá)BVDV NADL糖蛋白慢病毒載體的構(gòu)建
            2.10 BVDV NADL糖蛋白過表達(dá)的慢病毒構(gòu)建并感染MDBK細(xì)胞
            2.11 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)BVDV NADL糖蛋白的表達(dá)情況
            2.12 Western blot檢測(cè)慢病毒感染后BVDV NADL糖蛋白表達(dá)水平
            2.13 電鏡觀察慢病毒感染對(duì)MDBK細(xì)胞自噬的影響
            2.14 激光共聚焦觀察慢病毒感染MDBK細(xì)胞中GFP-LC3 puncta分布情況
            2.15 統(tǒng)計(jì)慢病毒感染后GFP-LC3 puncta陽性細(xì)胞率
            2.16 Western blot檢測(cè)慢病毒感染后自噬底物p62/SQSTM1的表達(dá)水平
            2.17 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)慢病毒感染后ATG14和Beclin1的轉(zhuǎn)錄水平
            2.18 Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白ATG14和Beclin1的蛋白水平
        3 討論
            3.1 自噬檢測(cè)手段
            3.2 黃病毒科病毒的結(jié)構(gòu)蛋白
            3.3 病毒與自噬相互作用
        4 小結(jié)
    實(shí)驗(yàn)二 細(xì)胞自噬改變對(duì)BVDV NADL復(fù)制的影響研究
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 結(jié)果
            2.1 自噬抑制劑 3-MA和渥曼青霉素處理能顯著性抑制細(xì)胞自噬的水平
            2.2 自噬抑制劑 3-MA和渥曼青霉素處理顯著性抑制BVDV NADL的復(fù)制
            2.3 自噬誘導(dǎo)劑rapamycin處理后能顯著性增加細(xì)胞自噬的水平
            2.4 早期細(xì)胞自噬有助于BVDV NADL胞內(nèi)復(fù)制
            2.5 Beclin 1 和LC3 干擾效率的檢測(cè)
            2.6 Beclin 1 和LC3 干擾后顯著性抑制細(xì)胞自噬的水平
            2.7 Beclin 1 和LC3 干擾后顯著性抑制BVDV NADL的復(fù)制
        3 討論
            3.1 自噬對(duì)BVDV復(fù)制的影響
            3.2 自噬抑制劑的作用
            3.3 自噬促進(jìn)劑的作用
            3.4 自噬相關(guān)蛋白的抑制
        4 小結(jié)
    實(shí)驗(yàn)三 mi R-29b影響B(tài)VDV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬及BVDV復(fù)制的分子機(jī)制研究
        1 材料與方法
            1.1 材料與試劑
            1.2 方法
        2 結(jié)果
            2.1 表達(dá)紅色熒光蛋白的慢病毒載體p LL3.7-td-Tomato構(gòu)建
            2.2 pre-mi R-29b表達(dá)的慢病毒載體構(gòu)建
            2.3 慢病毒pre-mi R-29b-lv和Antagomir-29b處理后mi R-29b的轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)
            2.4 BVDV NADL感染后mi R-29b的轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)
            2.5 自噬通路中mi R-29b靶蛋白預(yù)測(cè)
            2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建
            2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因分析鑒定mi R-29b靶蛋白
            2.8 實(shí)時(shí)定量PCR鑒定mi R-29b靶基因的轉(zhuǎn)錄水平
            2.9 Western blot鑒定mi R-29b靶蛋白的表達(dá)水平
            2.10 激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞自噬
            2.11 Western blot檢測(cè)自噬底物p62/SQSTM1 蛋白水平
            2.12 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)BVDV NADL E1 轉(zhuǎn)錄水平
            2.13 感染后不同時(shí)間點(diǎn)BVDV NADL滴度測(cè)定
            2.14 ATG14 和ATG9A慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建
            2.15 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)ATG14 和ATG9A的轉(zhuǎn)錄水平
            2.16 Western blot檢測(cè)ATG14 和ATG9A的表達(dá)水平
            2.17 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)GFP-LC3 puncta分布和統(tǒng)計(jì)分析自噬細(xì)胞率
            2.18 ATG14 和ATG9A過表達(dá)對(duì)自噬底物p62 表達(dá)的影響
            2.19 ATG14 和ATG9A過表達(dá)對(duì)BVDV NADL復(fù)制水平的影響檢測(cè)
        3 討論
            3.1 mi RNA與病原體復(fù)制
            3.2 mi R-29 家族的功能
        4 小結(jié)
    實(shí)驗(yàn)四 mi R-29b影響細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究
        1 材料與方法
            1.1 材料與試劑
            1.2 方法
        2 結(jié)果
            2.1 mi R-29b mimics顯著性抑制MDBK細(xì)胞凋亡
            2.2 mi R-29b靶向凋亡相關(guān)基因caspase-7 和NAIF1
            2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建
            2.4 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析
            2.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)caspase-7 和NAIF1 轉(zhuǎn)錄水平
            2.6 Western blot檢測(cè)caspase-7 和NAIF1 蛋白水平
            2.7 Caspase-7 和NAIF1 慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.8 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)慢病毒感染后caspase-7 和NAIF1 轉(zhuǎn)錄水平
            2.9 Western blot檢測(cè)慢病毒感染后caspase-7 和NAIF1 蛋白水平
            2.10 慢病毒感染后MDBK細(xì)胞凋亡水平檢測(cè)
        3 討論
            3.1 細(xì)胞凋亡與病原體
            3.2 病毒調(diào)控細(xì)胞凋亡的機(jī)制
        4 小結(jié)
    實(shí)驗(yàn)五 BVDV NADL定點(diǎn)突變株的構(gòu)建
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 結(jié)果
            2.1 成功構(gòu)建T7RNAP基因原核表達(dá)載體
            2.2 原核表達(dá)T7RNAP蛋白鑒定
            2.3 成功構(gòu)建T7RNAP基因慢病毒表達(dá)載體
            2.4 慢病毒包裝
            2.5 嘌呤霉素篩選T7RNAP穩(wěn)定表達(dá)的MDBK細(xì)胞
            2.6 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)T7RNAP m RNA水平
            2.7 p ET-32a-IRES-EGFP載體構(gòu)建
            2.8 T7 RNA聚合酶活性檢測(cè)
            2.9 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)MDBK-T7RNAP細(xì)胞系T7RNAP基因表達(dá)穩(wěn)定性
            2.10 Western blot檢測(cè)MDBK-T7RNAP細(xì)胞系T7 RNA聚合酶活性的穩(wěn)定性
            2.11 成功構(gòu)建E2 和NS4B定點(diǎn)突變的質(zhì)粒p ACNR/NADL-E2M和p ACNR/NADL-NS4BM
            2.12 不同毒株的復(fù)制曲線
            2.13 不同毒株的生長曲線
            2.14 BVDV NADL E2M和NS4BM穩(wěn)定性檢測(cè)
            2.15 不同毒株免疫產(chǎn)生小鼠Ig G抗體水平檢測(cè)
        3 討論
            3.1 正鏈RNA病毒的反向遺傳學(xué)
            3.2 負(fù)鏈RNA病毒的反向遺傳學(xué)
            3.3 反向遺傳學(xué)構(gòu)建的標(biāo)記性疫苗
        4 小結(jié)
第三部分 全文總結(jié)
創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介
導(dǎo)師評(píng)閱表

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王克棟;熊浩;季新成;冉多良;彭武麗;于學(xué)輝;史茜;;牛病毒性腹瀉病毒1型和2型雙重RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2013年10期

本文編號(hào)：2836853