背景:軟骨細(xì)胞是軟骨組織工程最常用的種子細(xì)胞,但是如何在體外擴增的同時又能維持其良好的軟骨表型是研究的重點和難點之一。目的:通過微載體動態(tài)培養(yǎng)法,明確三維動態(tài)培養(yǎng)對耳郭軟骨細(xì)胞增殖和分化的影響,為建立規(guī)模化擴增方法提供技術(shù)參考。方法:應(yīng)用胰酶、膠原酶消化法分離、培養(yǎng)豬耳軟骨細(xì)胞,并將獲得的軟骨細(xì)胞分為3組:培養(yǎng)皿單層培養(yǎng)、微載體三維靜止培養(yǎng)和微載體三維動態(tài)培養(yǎng)。應(yīng)用掃描電鏡、熒光倒置顯微鏡、DIO熒光染色、冰凍切片DAPI染色觀察細(xì)胞在微球上生長情況,DNA定量檢測軟骨細(xì)胞增殖能力,Real-time PCR檢測軟骨相關(guān)基因表達(dá)差異。結(jié)果與結(jié)論:①第1代軟骨細(xì)胞可快速貼附于CultispherG多孔微載體表面,微載體動態(tài)培養(yǎng)組細(xì)胞數(shù)量多于微載體靜止培養(yǎng)組,而且微載體動態(tài)培養(yǎng)組細(xì)胞分布更為均勻;②培養(yǎng)皿單層培養(yǎng)時,軟骨細(xì)胞在4d時進入平臺期,微載體動態(tài)培養(yǎng)組軟骨細(xì)胞對數(shù)生長期延長為2-10 d,細(xì)胞數(shù)量在14 d達(dá)到高峰,微載體靜止培養(yǎng)組細(xì)胞增殖速度緩慢;③在長期體外培養(yǎng)中,二維培養(yǎng)和微載體靜止培養(yǎng)軟骨表型喪失,而微載體三維動態(tài)培養(yǎng)在促進細(xì)胞增殖的同時,能夠維持軟骨表型;④結(jié)果表明,微載...

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圖4三種培養(yǎng)方法軟骨分化相關(guān)基因表達(dá)量單層培養(yǎng)組0.40.201.00.500.151.00.80.050.040.030.020.01P<0.05ACAN相對表COL2相對表達(dá)(×SOX9相對表達(dá)(表達(dá)

7.3倍，微載體靜止培養(yǎng)組細(xì)胞總量增加約2.2倍。在培養(yǎng)第14天，微載體動態(tài)培養(yǎng)組細(xì)胞數(shù)量顯著高于另外2組(P<0.001)，培養(yǎng)皿單層培養(yǎng)組高于微載體靜止培養(yǎng)組(P<0.05)。2.3軟骨細(xì)胞表型相關(guān)基因表達(dá)各組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)21d時，軟骨基質(zhì)特異性基因ACAN和COL2相對表達(dá)....

圖4三種培養(yǎng)方法軟骨分化相關(guān)基因表達(dá)量1.00.50SOX9相對表達(dá)(

7.3倍，微載體靜止培養(yǎng)組細(xì)胞總量增加約2.2倍。在培養(yǎng)第14天，微載體動態(tài)培養(yǎng)組細(xì)胞數(shù)量顯著高于另外2組(P<0.001)，培養(yǎng)皿單層培養(yǎng)組高于微載體靜止培養(yǎng)組(P<0.05)。2.3軟骨細(xì)胞表型相關(guān)基因表達(dá)各組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)21d時，軟骨基質(zhì)特異性基因ACAN和COL2相對表達(dá)....

圖2微球靜止培養(yǎng)組和微球動態(tài)培養(yǎng)組培養(yǎng)21d時倒置顯微鏡、掃描電鏡、DIO熒光、冰凍切片DAPI染色結(jié)果Figure2Resultsofinvertedmicroscope,electronmicroscope,DAPI染色μm200μm200

d時，軟骨基質(zhì)特異性基因ACAN和COL2相對表達(dá)量在微載體動態(tài)培養(yǎng)組表達(dá)最高，與其他2組比較差異有顯著性意義。SOX9基因相對表達(dá)量在3組之間差異無顯著性意義。COMP基因相對表達(dá)量在微載體動態(tài)培養(yǎng)組和微載體靜止培養(yǎng)組之間差異有顯著性意義，見圖4�！�4×10第1代第6代圖注：第....

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