發(fā)布時(shí)間：2020-11-09 09:54

【摘要】：禽白血病病毒(Avian leucosis virus,ALV)、馬立克病病毒(Marerk’s disease virus,MDV)、傳染性法氏囊病病毒(Infectious butsal disease virus,IBDV)是引發(fā)家禽免疫抑制病的主要病毒性病原。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)是引發(fā)家禽呼吸道疾病的重要病毒性病原。由于傳統(tǒng)的診斷檢測(cè)方法難以進(jìn)行多病原或多病原型的聯(lián)合檢測(cè),使生產(chǎn)上發(fā)生的同類型疫病短時(shí)間內(nèi)難以鑒別。考慮到家禽疫病防控急需,基于上述六種病原的高通量同步檢測(cè)和部分病原同步分型檢測(cè)方法尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)合金標(biāo)銀染顯色技術(shù),構(gòu)建ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV六種禽病毒病同步共檢基因芯片和H5-H7-H9-N1-N9-N2六種禽流感病毒亞型的同步共檢可視化基因芯片,對(duì)芯片的制備及檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行條件優(yōu)化,并對(duì)臨床初步應(yīng)用進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究主要結(jié)果如下:一、ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV共檢基因芯片構(gòu)建、檢測(cè)條件優(yōu)化和質(zhì)量評(píng)價(jià)1.ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV共檢基因芯片構(gòu)建與檢測(cè)條件優(yōu)化。以ALV、MDV、IBDV的全基因組為模板,克隆得到ALV-ENV、MDV-MEQ及IBDV-VP2基因序列,設(shè)計(jì)寡核苷酸探針,成功制備ALV-MDV-IBDV-AIV-NDV-ILTV共檢基因芯片(簡(jiǎn)稱共檢芯片Ⅰ)。對(duì)基因芯片的制備過(guò)程和檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)寡核苷酸探針最優(yōu)使用濃度為50μmol/L,40℃條件下雜交2h,Nanogold-Streptavidin鏈霉親和素溶液的使用濃度為4μg/mL,染色時(shí)間為5min,對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本最終銀染顯色可見(jiàn)明顯檢測(cè)信號(hào)。2.對(duì)構(gòu)建的此基因芯片進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。芯片檢測(cè)特異性試驗(yàn)顯示,ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV、ILTV之間無(wú)交叉反應(yīng),特異性好,且以IBV為模板制備的PCR擴(kuò)增標(biāo)記不與共檢芯片Ⅰ雜交;敏感性試驗(yàn)顯示,芯片的最低檢測(cè)濃度是1pg/μl。穩(wěn)定性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),基因芯片能在常溫條件下進(jìn)行有效保存不少于60 d,4℃條件下保存不少于75 d。二、禽流感H5-H7-H9-N1-N9-N2六種亞型聯(lián)合共檢可視化基因芯片的構(gòu)建、檢測(cè)條件優(yōu)化和質(zhì)量評(píng)價(jià)1.H5-H7-H9-N1-N9-N2共檢基因芯片構(gòu)建與檢測(cè)條件優(yōu)化。以H5N6、H7N9和H9N2禽流感病毒毒株的全基因組,以及合成制備的H5N1毒株的NA保守序列片段,克隆得到H5-HA、H7-HA、H9-HA、N1-NA、N9-NA和N2-NA共6個(gè)靶基因,并成功制備出H5-H7-H9-N1-N9-N2共檢基因芯片(簡(jiǎn)稱共檢芯片Ⅱ);對(duì)基因芯片的制備過(guò)程和檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)使用濃度為50μmol/L的寡核苷酸探針與含有生物素標(biāo)記的靶基因PCR產(chǎn)物45℃條件下雜交2h,Nanogold-Streptavidin鏈霉親和素溶液的最佳使用濃度為4μg/mL,銀染7min,陽(yáng)性標(biāo)本銀染顯色可見(jiàn)明顯的檢測(cè)信號(hào)。2.對(duì)構(gòu)建的此基因芯片進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。基因芯片的特異性試驗(yàn)顯示芯片特異性高,無(wú)交叉反應(yīng),且以ALV、MDV、IBDV、NDV、IBV、ILTV為模板制備的PCR擴(kuò)增標(biāo)記不與共檢芯片Ⅱ雜交;敏感性試驗(yàn)顯示芯片的敏感性好,H5和N1亞型芯片的最低檢測(cè)濃度是1×10~(-10)ng\ul,H7亞型芯片的最低檢測(cè)濃度是1×10~(-8)ng\ul,N9亞型檢測(cè)芯片的最低檢測(cè)濃度是1×10~(-7)ng\ul,H9和N2亞型芯片的最低檢測(cè)濃度是1×10~(-8)ng\ul,均不同程度的高于RT-PCR檢測(cè)技術(shù);穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示,本研究建立的可視化芯片4℃條件下可保存不少于90d。三、共檢芯片Ⅰ和共檢芯片Ⅱ的初步臨床應(yīng)用將本研究構(gòu)建的兩套基因芯片對(duì)四川安岳、彭州、瀘州、廣元、自貢、樂(lè)山、廣漢、溫江、重慶、山東等地區(qū)疑似患禽白血病、馬立克病、傳染性法氏囊病、禽流感、新城疫和傳染性喉氣管炎的155份臨床送檢樣品進(jìn)行檢測(cè),其中,六類禽病毒病基因芯片的檢測(cè)結(jié)果為ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV、ILTV的陽(yáng)性檢出率分別為7%、1.2%、0.6%、5.8%、14.8%、0%,其中混合感染ALV和AIV為4.5%,NDV和AIV為2.5%,ALV、MDV和IBDV為0.6%,ALV、AIV和NDV為1.2%,該檢測(cè)方法的敏感性略高于PCR/RT-PCR檢測(cè)方法,二者方法的符合率高于98%;H5-H7-H9-N1-N9-N2六種禽流感病毒亞型的同步共檢芯片的檢測(cè)結(jié)果為H5、H7、H9、N1、N9、N2的陽(yáng)性檢出率分別為4.3%、0%、43.4%、0%、34.7%、4.3%,其中H9N9亞型檢出率為21.7%,H9N2亞型檢出率為4.3%,H5和H9亞型共同感染檢出率為4.3%,該檢測(cè)方法與RT-PCR方法相比,敏感性為100%,特異性高于92.8%,符合率高于95.6%,對(duì)二者結(jié)果進(jìn)行差方檢驗(yàn)的Kappa值均0.80,表明兩種檢測(cè)方法具有很好的一致性。綜上,本研究成功構(gòu)建ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV六種禽病毒病同步共檢基因芯片和H5-H7-H9-N1-N9-N2六種禽流感病毒亞型同步共檢基因芯片,兩種基因芯片具備較好的特異性、靈敏性和穩(wěn)定性,能有效應(yīng)用于上述禽類疫病的臨床樣本檢測(cè),為此類禽疫病的快速鑒別診檢提供了新的先進(jìn)手段。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S855.3
【圖文】：

個(gè)為 NDV-F 基因，第四排前三個(gè)為 AIV-NP 基因, 第四排后三個(gè)為 ILTV-TK 基因，如圖 2-1。圖2-1 基因芯片矩陣設(shè)計(jì)圖Fig. 2-1 The design of DNA microarray2.2.5.2 可視化基因芯片探針的稀釋將點(diǎn)樣緩沖液和 ddH2O 按 1:4 的比例混勻，用以稀釋合成的寡核苷酸探針，調(diào)整其終濃度為 50μmol/L。吸取稀釋的寡核苷酸探針混合液 80μL 輕輕加至 384 孔板相應(yīng)的孔中，每個(gè)孔代表一種靶基因的探針稀釋液，兩種靶基因的孔之間間隔兩個(gè)孔的位置，以免靶基因混合液之間污染（注意探針混合液在孔內(nèi)不能有氣泡）。將 384 孔板放于點(diǎn)樣儀相應(yīng)的位置上。同時(shí)，將醛基玻片置于點(diǎn)樣儀的模塊上，在點(diǎn)樣之前，對(duì)點(diǎn)樣儀進(jìn)行一次校正。2.2.5.3 可視化基因芯片點(diǎn)樣儀的校正打開(kāi)電腦、點(diǎn)樣儀電源，點(diǎn)樣針裝入點(diǎn)樣儀相應(yīng)的位置。電腦上打開(kāi)晶芯 PersonalArrayer 16 操作軟件，自檢結(jié)束后進(jìn)入設(shè)置界面，控制點(diǎn)樣儀內(nèi)環(huán)境濕度為 50 %以上，分別進(jìn)行噴樣準(zhǔn)備、玻片設(shè)置、點(diǎn)陣設(shè)置、樣品設(shè)置和清洗設(shè)置操作。在噴樣準(zhǔn)備中，分別校正清洗位置、抽干位置、第一片玻片位置、預(yù)噴位置、樣品孔板 A24 孔位置、排空位置。玻片設(shè)置中 OX: 5.5mm

22圖2-2 靶基因鑒定結(jié)果M：2000bp DNALadder； 1：λ 定位基因； 2：ALV-ENV；3：MDV-MEQ；4：IBDV-VP2；5：NDV-F；6：ILTV-TK；7：AIV-NP；N：陰性對(duì)照Fig. 2-2 The identification results of target geneM: 2000bp DNA Ladder; 1: λ; 2: ALV-ENV; 3: MDV-MEQ;4: IBDV-VP2; 5: NDV-F; 6: ILTV-TK; 7: AIV-NP; N: Negative control2.3.2 基因芯片制備的初檢2.3.2.1 陽(yáng)性定位基因的檢測(cè)以 λ 定位基因?yàn)槟０暹M(jìn)行靶基因擴(kuò)增標(biāo)記，將 λDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物與含 6 種禽病毒病探針的芯片進(jìn)行雜交，銀染顯色，肉眼觀察試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示陽(yáng)性質(zhì)控 λ 定位基因雜交斑點(diǎn)明顯可見(jiàn)，陰性對(duì)照和其它探針斑點(diǎn)沒(méi)有可見(jiàn)雜交斑點(diǎn)（圖 2-3）。表明本研究制備的醛基基片及陽(yáng)性定位基因質(zhì)量可靠。2.3.2.2 共檢芯片全基因的檢測(cè)6 種禽病毒病 6 個(gè)探針基因的全部探針位點(diǎn)均可以看到明顯的雜交斑點(diǎn)，陽(yáng)性對(duì)照斑點(diǎn)明顯，陰性對(duì)照沒(méi)有可見(jiàn)雜交斑點(diǎn)，表明制備的可視化共檢芯片、選用探針基因質(zhì)量可靠（圖 2-4）。

.3.3.1 噴樣次數(shù)優(yōu)化結(jié)果結(jié)果顯示，一次或兩次噴樣時(shí)，斑點(diǎn)信號(hào)差別不明顯，但當(dāng)?shù)谌�次噴樣時(shí)，探針出現(xiàn)位移導(dǎo)致雜交信號(hào)連在一起，影響最終雜交結(jié)果的判定。且隨著噴樣次數(shù)的增加驗(yàn)成本和時(shí)間增加。因此，選擇一次噴樣制備芯片（見(jiàn)圖 2-5）。
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本文編號(hào)：2876245