發(fā)布時間：2020-11-10 23:09

　　 豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一種具有高度傳染性的病毒性疾病,世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報告的動物傳染病,我國將其列為一類動物疫病。CSFV對免疫系統(tǒng)的細胞有很強的親和力,能夠在巨噬細胞和樹突狀細胞中復(fù)制,并且引起細胞的一些抗病毒反應(yīng)。病毒在它們生命周期的各個階段都會與細胞膜上的脂質(zhì)相互作用并調(diào)節(jié)脂質(zhì)的代謝,這樣能夠幫助它們?nèi)肭�、�?fù)制裝配以及病毒的釋放。本文主要圍繞豬瘟病毒對IL-1β的釋放以及膽固醇在豬瘟病毒感染中的作用展開了研究,獲得了以下結(jié)果:(1)應(yīng)用實時熒光定量PCR、ELISA等方法,證明豬瘟病毒感染能夠誘導(dǎo)IL-1β的釋放,Western blot檢測發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒感染后能夠活化caspase-1,利用caspase-1的抑制劑證明豬瘟病毒是通過活化caspase-1來誘導(dǎo)IL-1β的釋放�；钚匝�(ROS)在IL-1β的釋放過程中起到了一定的作用,利用ROS探針發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒感染能夠上調(diào)巨噬細胞中ROS水平,并用ROS抑制劑PDTC證實了ROS并不參與豬瘟病毒誘導(dǎo)的IL-1β的釋放。(2)提取CSFV感染的細胞總RNA,以反轉(zhuǎn)錄的c DNA為模板擴增得到CSFV p7基因的全長序列為210 bp,根據(jù)p EGFP-C3質(zhì)粒圖譜,成功構(gòu)建了重組真核表達質(zhì)粒p EGFP-p7并經(jīng)過酶切和測序鑒定。將獲得的陽性質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)染豬臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(SUVEC)與豬巨噬細胞,G418(1500μg/m L)篩選等過程,經(jīng)RT-PCR和Western blot鑒定后,成功得到了穩(wěn)定表達CSFV p7蛋白的細胞株。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)CSFV p7蛋白能夠誘導(dǎo)IL-1β的釋放,并且這種作用能夠被離子通道抑制劑金剛烷胺所抑制。另外,利用蛋白酶體抑制劑MG132的作用,發(fā)現(xiàn)CSFV p7蛋白在不同的細胞系中都是一種不穩(wěn)定的蛋白,會快速地通過蛋白酶體途徑降解,而通過抑制降解發(fā)現(xiàn),CSFV p7蛋白的增加會促進IL-1β的釋放。研究結(jié)果為豬瘟病毒誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)機制提供了理論依據(jù)。(3)用膽固醇去除劑MβCD先孵育細胞1h來去除細胞膜上的膽固醇,然后感染豬瘟病毒,發(fā)現(xiàn)膽固醇的耗竭能夠抑制豬瘟病毒入侵細胞,而且這種效果與MβCD劑量呈正相關(guān)。同樣地,先用豬瘟病毒感染細胞,然后用MβCD去除細胞膜上膽固醇,發(fā)現(xiàn)膽固醇的耗竭同樣能夠抑制CSFV的復(fù)制增殖。為了驗證MβCD對豬瘟病毒感染產(chǎn)生的影響是否為可逆的,進行了外源性膽固醇添加試驗,發(fā)現(xiàn)添加外源性膽固醇能夠部分中和MβCD處理對CSFV感染的影響。(4)將MβCD與豬瘟病毒混勻作用1h,用來去除豬瘟病毒囊膜上的膽固醇,為了排除藥物的影響,將混合物稀釋100倍后感染細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)去除病毒囊膜上的膽固醇大大降低了豬瘟病毒的感染力。為了補充病毒囊膜上的膽固醇,添加了外源性的膽固醇到MβCD處理過的豬瘟病毒中作用1h,稀釋100倍后再去感染細胞,發(fā)現(xiàn)添加了外源性膽固醇能夠部分恢復(fù)豬瘟病毒的感染性。(5)通過實時熒光定量PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒感染能夠上調(diào)caveolin-1的表達。利用sh RNA,通過轉(zhuǎn)染,嘌呤霉素的篩選(4μg/m L)以及鑒定,成功獲得了一株能夠干擾caveolin-1的細胞株。結(jié)果表明,干擾caveolin-1后,豬瘟病毒的復(fù)制增加了。說明caveolin-1介導(dǎo)的內(nèi)吞作用在豬瘟病毒入侵細胞中并不起作用。綜上所述,本研究通過試驗發(fā)現(xiàn)CSFV能夠通過激活caspase-1來誘導(dǎo)IL-1β的表達以及成熟,而ROS并不參與其中。進一步試驗發(fā)現(xiàn)CSFV p7蛋白能誘導(dǎo)IL-1β的表達,而且這種作用能被離子通道抑制劑金剛烷胺抑制。研究結(jié)果為CSFV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)機制提供了理論依據(jù)。此外,通過膽固醇去除試驗發(fā)現(xiàn)細胞膜上膽固醇的耗竭不僅能夠抑制CSFV的入侵,在CSFV的復(fù)制階段也起了一定的作用,添加外源性的膽固醇能夠部分中和這種效果。后續(xù)的試驗發(fā)現(xiàn)CSFV感染能夠上調(diào)caveolin-1的表達,干擾caveolin-1后CSFV的增殖會增加,證明CSFV入侵細胞并不是通過caveolin-1介導(dǎo)的內(nèi)吞,這為闡明脂筏在CSFV生命周期中的作用提供了一定的理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S858.28
【文章目錄】：
摘要
abstract
文獻綜述
    第一章 病原感染過程中炎性小體的活化和IL-1β 釋放研究進展
        1.1 炎性小體及其功能
        1.2 抗病毒免疫反應(yīng)中的IL-1β 和IL-18
        1.3 病毒感染中炎性小體的激活
            1.3.1 NLRP3 炎性小體
            1.3.2 AIM2 炎性小體
            1.3.3 IFI16 炎性小體
            1.3.4 RIG-I炎性小體
        1.4 炎性小體激活病毒性逃避和效應(yīng)功能
        1.5 抑制炎性小體組裝
            1.5.1 抑制caspase-1 功能
            1.5.2 IL-1β 和IL-18 的中和作用
        1.6 Viroporin激活炎性小體
        1.7 展望
    第二章 脂筏和膽固醇在病毒感染中的作用研究進展
        2.1 脂筏的功能及脂筏途徑
            2.1.1 發(fā)動蛋白依賴的脂筏途徑
            2.1.2 非發(fā)動蛋白依賴的脂筏途徑
        2.2 脂筏在病毒感染中的作用
        2.3 脂筏作為病毒進入的平臺
            2.3.1 非囊膜病毒
            2.3.2 囊膜病毒
        2.4 脂筏在病毒復(fù)制、裝配和釋放中的作用
            2.4.1 非囊膜病毒
            2.4.2 囊膜病毒
        2.5 展望
試驗研究
    第三章 豬瘟病毒感染對IL-1β 釋放的影響
        3.1 材料
            3.1.1 病毒，細胞與主要試劑
            3.1.2 主要溶液的配制
            3.1.3 主要儀器設(shè)備
        3.2 方法
            3.2.1 實時熒光定量PCR
            3.2.2 Western blot
            3.2.3 豬瘟病毒感染誘導(dǎo)IL-1β 釋放的檢測
            3.2.4 ROS是否參與豬瘟病毒感染誘導(dǎo)IL-1β 釋放的檢測
            3.2.5 豬瘟病毒感染激活caspase-1 的檢測
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 豬瘟病毒感染誘導(dǎo)IL-1β 釋放
            3.3.2 豬瘟病毒感染誘導(dǎo)IL-1β 釋放需要病毒的復(fù)制
            3.3.3 CSFV感染能夠上調(diào)ROS水平
            3.3.4 ROS不參與CSFV誘導(dǎo)的IL-1β 釋放
            3.3.5 CSFV感染激活caspase-1
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
    第四章 豬瘟病毒p7 蛋白誘導(dǎo)IL-1β 釋放的研究
        4.1 材料
        4.2 方法
            4.2.1 克隆CSFV p7 基因序列及分析
            4.2.2 真核表達載體pEGFP-p7 的構(gòu)建
            4.2.3 pEGFP-p7 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的建立
            4.2.4 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的鑒定
            4.2.5 CSFV p7 蛋白誘導(dǎo)IL-1β 釋放的檢測
            4.2.6 CSFV p7 蛋白降解特性的研究
            4.2.7 MG132 和amantadine對CSFV p7 誘導(dǎo)的IL-1β 釋放的影響
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 擴增CSFV p7 基因及序列分析
            4.3.2 真核表達載體pEGFP-p7 的構(gòu)建
            4.3.3 穩(wěn)定表答CSFV p7 蛋白的細胞株的建立及鑒定
            4.3.4 CSFV p7 蛋白誘導(dǎo)IL-1β 釋放
            4.3.5 CSFV p7 蛋白是一種不穩(wěn)定的蛋白
            4.3.6 MG132 和amantadine對CSFV p7 誘導(dǎo)的IL-1β 釋放的影響
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
    第五章 膽固醇在豬瘟病毒感染中的作用
        5.1 材料
        5.2 方法
            5.2.1 MTT法檢測甲基-β-環(huán)糊精（MβCD）對巨噬細胞毒性
            5.2.2 細胞質(zhì)膜及病毒囊膜上膽固醇的去除與補充
            5.2.3 去除細胞質(zhì)膜上的膽固醇對CSFV入侵的影響
            5.2.4 不同濃度MβCD處理對CSFV入侵的影響
            5.2.5 細胞質(zhì)膜上的膽固醇耗竭對CSFV入侵細胞后的影響
            5.2.6 病毒囊膜上膽固醇的耗竭對CSFV入侵細胞的影響
        5.3 結(jié)果
            5.3.1 MβCD細胞毒性的測定
            5.3.2 去除膽固醇影響CSFV的入侵
            5.3.3 膽固醇的耗竭影響CSFV的復(fù)制
            5.3.4 添加外源性膽固醇能夠部分逆轉(zhuǎn)MβCD處理對CSFV的影響
            5.3.5 病毒囊膜上的膽固醇影響CSFV感染
        5.4 討論
        5.5 小結(jié)
    第六章 豬瘟病毒感染對caveolin-1 表達的影響
        6.1 材料
        6.2 方法
            6.2.1 caveolin-1 引物的設(shè)計
            6.2.2 CSFV感染后巨噬細胞 3D4/2 中caveolin-1 表達的檢測
            6.2.3 確定嘌呤霉素篩選濃度
            6.2.4 caveolin-1 干擾細胞的篩選
            6.2.5 caveolin-1 干擾細胞干擾效果的檢測
            6.2.6 干擾caveolin-1 后對CSFV感染的影響
        6.3 結(jié)果
            6.3.1 CSFV上調(diào)caveolin-1 的表達
            6.3.2 caveolin-1 干擾細胞的篩選
            6.3.3 caveolin-1 干擾細胞株的鑒定
            6.3.4 干擾caveolin-1 后對CSFV感染的影響
        6.4 討論
        6.5 小結(jié)
結(jié)論
本論文的創(chuàng)新點
有待于進一步研究的問題
參考文獻
主要縮略詞和中英文對照表（Abbreviation Index）
致謝
作者簡介

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本文編號：2878434