【摘要】：研究背景MDSC(Myeloid derived suppressor cell)是髓系來源的免疫抑制細(xì)胞,在急慢性炎癥、腫瘤及重癥感染等疾病中MDSC明顯增多,且負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase)/蛋白激酶B(protein kinase B)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin)/p70S6k(簡稱m TOR)信號通路,主要調(diào)控細(xì)胞的生長分化,其還可改變下游效應(yīng)分子的活化狀態(tài),影響細(xì)胞凋亡、增殖、血管生成及轉(zhuǎn)化,參與核糖體合成、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、細(xì)胞凋亡和生長。研究發(fā)現(xiàn)多種疾病的發(fā)生及發(fā)展與m TOR號通路的改變相關(guān),其非常有希望成為治療新靶點(diǎn)。支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種慢性炎癥性疾病,已經(jīng)嚴(yán)重危害了兒童的身心健康,并且70%-80%的兒童發(fā)病年齡小于5歲,如果不能及時(shí)的明確診斷并給予有效治療治,將會隨著病程的延長產(chǎn)生氣道重塑,從而失去最佳的治療時(shí)機(jī),對孩子傷害更大。MDSC及m TOR信號通路已廣泛應(yīng)用于腫瘤的研究及臨床治療中,而在哮喘中的研究較少,且在哮喘發(fā)病中發(fā)病機(jī)制未明確,此外,二者是否共同在哮喘中起作用及如何作用尚未見報(bào)道。鑒于此,我們將分三部分研究二者在哮喘中的作用及機(jī)制。第一部分內(nèi)源、外源MDSC引起Th1/Th2失衡在哮喘發(fā)生中的作用及機(jī)制研究目的探討內(nèi)源、外源MDSC與Th1/Th2失衡在哮喘發(fā)生中的分子機(jī)制。材料和方法為了研究內(nèi)源MDSC在哮喘發(fā)生中的作用,通過臨床研究設(shè)哮喘組、干預(yù)組與對照組,ELISA檢測各組外周血清IL-10、IL-12水平,流式細(xì)胞檢測外周血MDSC比例,并分析MDSC與IL-10、IL-12的相關(guān)性;同時(shí)建立動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?設(shè)哮喘組、干預(yù)組及對照組,HE、PAS染色觀察各組氣道炎癥,免疫組化染色觀察各組MDSC、IL-10及IL-12水平;為了探討外源MDSC在哮喘中的抑制作用,建立大腸癌小鼠模型,標(biāo)記并提取MDSC,注入哮喘小鼠模型中,分為對照組,哮喘組,干預(yù)組及移植組,觀察各組哮喘氣道重塑的表達(dá),檢測各組血清及BALF中IL-10及IL-12水平,分析移植組MDSC與IL-10,MDSC與IL-12的相關(guān)性。結(jié)果1.哮喘發(fā)作組血清MDSC與IL-10水平均顯著升高,且兩者呈正相關(guān),發(fā)作組的IL-12水平顯著下降,MDSC與IL-12呈負(fù)相關(guān)。(1)發(fā)作組較緩解組、肺炎組及對照組外周血單個(gè)核細(xì)胞MDSC比例及血清IL-10水平均顯著升高(p0.05);后三組血清IL-10水平及外周血單個(gè)核細(xì)胞MDSC比例均無顯著差異(p0.05);(2)發(fā)作組患兒血清IL-12水平較緩解組、肺炎組及對照組顯著降低(p0.05);后三組血清IL-12水平無顯著差異(p0.05);(3)發(fā)作組患兒血清IL-10與外周血單個(gè)核細(xì)胞MDSC比例呈正相關(guān)、IL-12與MDSC呈負(fù)相關(guān)。2.哮喘組小鼠氣道炎癥、氣道重塑顯著,肺組織MDSC及IL-10水平均顯著升高,IL-12水平顯著下降。(1)哮喘組小鼠HE及PAS染色較對照組相比,均表現(xiàn)明顯的氣道重塑,干預(yù)后氣道重塑明顯改善;(2)哮喘組小鼠肺組織IL-10及MDSC均顯著高于對照組,布地奈德干預(yù)后顯著下降(p均0.05),哮喘組小鼠IL-12水平顯著低于對照組,布地奈德干預(yù)后顯著上升(p0.05)。3.從骨髓細(xì)胞懸液中可提取較高比例的MDSC,外源MDSC移植入哮喘小鼠后氣道重塑顯著改善,肺組織MDSC及IL-10水平顯著下降,且兩者呈正相關(guān),IL-12水平干預(yù)后顯著上升,且與MDSC呈負(fù)相關(guān)。(1)制作大腸癌小鼠模型,骨髓細(xì)胞懸液中分離提取外源性MDSC比例為86.3%,顯著高于脾臟提取的56.2%;(2)外源MDSC移植入哮喘小鼠后,氣道炎癥、氣道重塑顯著改善,與干預(yù)組相比無顯著差別;(3)用免疫組化染色方法發(fā)現(xiàn)哮喘組MDSC呈高表達(dá),移植后呈低表達(dá);ELISA檢測哮喘組血清及BALF中IL-10升高、IL-12下降,移植后IL-10下降、IL-12升高,移植組IL-10與MDSC呈正相關(guān)、IL-12與MDSC呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論內(nèi)源MDSC增高時(shí)IL-10升高、IL-12降低,導(dǎo)致Th1/Th2失衡與哮喘發(fā)生相關(guān);外源MDSC可使IL-10降低、IL-12升高,糾正Th1/Th2失衡從而抑制哮喘。第二部分m TOR信號通路引起Th17/Treg失衡在哮喘中的作用及機(jī)制研究目的驗(yàn)證m TOR信號通路是否通過誘發(fā)Th17/Treg失衡從而在哮喘發(fā)生時(shí)起誘導(dǎo)作用,抑制通路的各個(gè)靶點(diǎn)是否通過糾正Th17/Treg失衡在哮喘發(fā)生時(shí)起抑制作用,比對不同的抑制劑應(yīng)用后各個(gè)靶點(diǎn)水平。材料與方法臨床研究設(shè)哮喘重度發(fā)作組、輕度發(fā)作組及緩解組、肺炎組及正常對照組,用ELISA分別測定各組血清的m TOR,IL-17及TGF-β水平;動物實(shí)驗(yàn)設(shè)生理鹽水對照組、卵蛋白哮喘組、布地奈德干預(yù)組,m TOR抑制劑(雷帕霉素)干預(yù)組,PI3K抑制劑(LY294002)干預(yù)組,Akt抑制劑(曲西立濱)干預(yù)組,各組分別應(yīng)用HE染色、PAS染色,各組p-PI3K、p-Akt、p-m TOR及p-p70S6K行免疫組織化學(xué)染色及Western blot檢測;分別用ELISA檢測BALF及血清中的IL-17及TGF-β水平。結(jié)果1.哮喘重度發(fā)作組較其余各組相比,血清中的m TOR及IL-17顯著升高,TGF-β顯著下降;m TOR與IL-17呈正相關(guān),與TGF-β呈負(fù)相關(guān);其余各組之間m TOR、IL-17及TGF-β水平無顯著差別;2.m TOR信號通路在哮喘發(fā)生時(shí)被激活,氣道重塑明顯,緩解時(shí)氣道重塑明顯改善;3.哮喘發(fā)作時(shí)免疫組化及Western blot檢測p-PI3K、p-Akt、p-m TOR及p-p70S6K水平均升高,干預(yù)后各指標(biāo)均顯著降低;4.p-PI3K表達(dá)水平在曲西立濱干預(yù)組顯著高于哮喘組,哮喘組又顯著高于其余各組;p-Akt在雷帕霉素干預(yù)組顯著高于哮喘組,哮喘組又顯著高于其余各組;p-m TOR及p-p70S6k的表達(dá)水平在哮喘組均顯著高于其余各組;5.哮喘發(fā)生時(shí)小鼠BALF及血清IL-17升高、TGF-β降低,哮喘緩解時(shí)BALF及血清IL-17降低、TGF-β升高。結(jié)論m TOR信號通路激活時(shí)可引起IL-17升高、TGF-β降低,從而導(dǎo)致Th17/Treg失衡在哮喘發(fā)生時(shí)起誘導(dǎo)作用;相反,哮喘緩解時(shí)m TOR信號通路被抑制,血清IL-17降低、TGF-β升高,Th17/Treg失衡被糾正;通路各個(gè)靶點(diǎn)水平在各個(gè)靶點(diǎn)抑制劑應(yīng)用后比對有差異。第三部分MDSC、m TOR信號通路通過i NOS及NO在哮喘的發(fā)生中相互作用目的驗(yàn)證MDSC、m TOR信號通路是否通過i NOS及NO在哮喘的發(fā)生中相互作用。材料和方法生理鹽水對照組,卵蛋白哮喘組,布地奈德干預(yù)組,檢測各組i NOSm RNA及NO表達(dá);哮喘組小鼠p-m TOR及p-p70S6K水平在外源MDSC注入前后的變化,注入前后i NOS及NO水平的變化,哮喘小鼠中用i NOS抑制劑(L-硝基精氨酸L-nitro-arginine LNA)注入前后p-m TOR及p-p70S6K水平變化;哮喘小鼠m TOR抑制劑(雷帕霉素)應(yīng)用后內(nèi)源MDSC、i NOS及NO的水平變化,用LNA注入哮喘小鼠中測定注入前后內(nèi)源MDSC水平的變化(各組i NOS及NO水平用ELISA檢測,各組p-m TOR及p-p70S6K用免疫組化染色及Western blot檢測);ELISA測定哮喘組血清m TOR及i NOS水平,用免疫組化測檢肺組織中MDSC水平,pearson直線相關(guān)分析其中兩兩的相關(guān)性。結(jié)果1.i NOS及NO水平在哮喘組顯著高于對照組、干預(yù)后顯著下降。2.哮喘組小鼠外源MDSC注入后p-m TOR、p-p70S6K,i NOS及NO水平均較注入前下降;LNA注入哮喘小鼠后p-m TOR及p-p70S6K水平均下降。3.雷帕霉素注入哮喘小鼠后內(nèi)源MDSC水平,i NOS及NO水平均較注入前下降;LNA注入哮喘小鼠后內(nèi)源MDSC水平均下降。4.ELISA測定哮喘組血清m TOR及i NOS水平,用免疫組化測肺組織中MDSC水平、pearson直線相關(guān)分析三者相關(guān)性,其中兩兩均呈正相關(guān)。結(jié)論雷帕霉素抑制了哮喘小鼠內(nèi)源MDSC的表達(dá),是通過抑制i NOS及NO的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的;外源MDSC下調(diào)了m TOR的表達(dá),是通過抑制i NOS及NO的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。
文內(nèi)圖片：
圖片說明：A各組單個(gè)核細(xì)胞MDSC，，血清IL-10，IL-12，IgE及EOS計(jì)數(shù)
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R725.6


本文編號：2512296