背景:慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是持續(xù)性氣流受限為特征的疾病,是全球重要的公共健康問題。在我國患病率高,60歲以上人群患病率高達13~30%,隨著老齡化社會的來臨,發(fā)病率還將持續(xù)上升。COPD患者存在臨床表現(xiàn)不一、疾病嚴重性與肺功能的嚴重程度不完全匹配、病情進行性加重遷延不愈、易并發(fā)多種肺內(nèi)肺外并發(fā)癥等問題,嚴重影響患者的生存質(zhì)量及生存時間。而目前的治療手段尚不能阻止肺功能的進行性下降,迫切需要開發(fā)新的治療措施延緩疾病的進展。篩選與疾病分級(嚴重程度)相關(guān)的生物學(xué)標志物及治療靶點對COPD患者定制個體化治療方案有重要指導(dǎo)作用。COPD是環(huán)境因素與宿主基因相互作用的多因素疾病,發(fā)病機制復(fù)雜,疾病緩慢進行性發(fā)展。目前普遍認為COPD與單核/巨噬細胞、中性粒細胞、T淋巴細胞引起的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及蛋白酶與抗蛋白酶失衡等有關(guān),而近年來遺傳易感性在COPD中的作用逐漸受到關(guān)注。miRNA是具有調(diào)控功能的非編碼RNA,參與調(diào)節(jié)許多重要的生物過程如:生長發(fā)育、細胞增殖、細胞分化、凋亡等,與肺部多種疾病的發(fā)生發(fā)展有密切的聯(lián)系,參與了多種肺部疾病的發(fā)病機制。由于mi RNA的穩(wěn)定性好,在血液中易于檢測,并具有特異性強、靈敏度高等特點,有可能成為COPD新型的分子標志物。因此尋找與COPD分級(嚴重程度)相關(guān)的miRNA,可為治療提供新靶點。進而對于參與疾病生物過程的miRNA進行功能分析,為COPD發(fā)病機制的研究提供新的方向,及未來定制個體化治療方案提供理論基礎(chǔ)。研究目的:1.采用小RNA高通量技術(shù),篩選與COPD分級(嚴重程度)相關(guān)的差異表達miRNAs,驗證其可否成為生物學(xué)標志物及治療的候選靶點。2.在體外細胞水平闡明候選mi RNA在COPD生物過程中的功能,及其對靶基因的調(diào)控機制,探索mi RNA在其發(fā)病機制中的作用,為COPD的治療提供新靶點。研究方法:1.按照2013年gold(globalinitiativeforchronicobstructivelungdisease)指南,選取山西大醫(yī)院呼吸科門診2014年1月至2014年12月診斷明確的copd穩(wěn)定期患者141例,進行綜合評估分組。根據(jù)入選排除標準最終納入本研究copd患者共20例,abcd組每組5例。健康對照組6例。所有參與者抽取外周血,分離白細胞,提取總rna,進行小rna高通量測序,運用生物信息學(xué)分析篩選copd各組間及臨床疾病發(fā)展模式中存在的差異性顯著性mirna、并進行g(shù)o和kegg通路分析。候選的mirna采用實時熒光定量pcr法在本地擴大樣本的copd患者80例中進行驗證。2.在體外通過rt-pcr檢測篩選驗證的mirnas在人單核thp-1細胞中表達量。構(gòu)建慢病毒感染細胞,mts活力檢測進行mirnas細胞功能的篩選。通過細胞功能學(xué)實驗(cck-8、pi-facs細胞周期、annexinv-apc細胞凋亡檢測)進一步明確mirnas在copd的功能。運用熒光素酶lucifersae檢測確定靶向mirna及其靶向基因間是否存在直接調(diào)控的作用。結(jié)果:1.(1)與健康對照組相比,在copd患者中有1715種表達差異顯著的mirnas,包括51種上調(diào)的mirnas,18種下調(diào)的mirnas。(2)在copdabcd各組中19種mirnas共同呈現(xiàn)差異表達顯著,17種mirnas在各組中共同上調(diào)。其中mir-106b-5p在a組中表達水平最高,在d組表達水平最低(abcd),而mir-125a-5p在copd組中表達水平明顯增高,其中在abc組中其表達量逐漸下降,但在d組其表達量出現(xiàn)轉(zhuǎn)折性增高。(3)在臨床疾病發(fā)展模式中從a組到b組到d組mir-183-5p的表達水平持續(xù)下調(diào)。(4)go分析顯示大部分的基因功能注釋集中在copd生物學(xué)過程,如細胞周期、凋亡、代謝、粘附等,部分基因涉及代謝、免疫、應(yīng)激、細胞信號等。(5)kegg通路分析顯示mirna相關(guān)靶基因與copd的許多重要信號通路及合并癥相關(guān),如細胞自噬的調(diào)節(jié),粘著斑,toll-like受體信號通路,癌癥相關(guān)通路,非小細胞癌,erbb信號通路及p53信號通路等。(6)候選出的mir-106b-5p、mir-125a-5p在本地copd樣本中進行實時熒光定量pcr驗證,與測序結(jié)果一致。2.(1)miR-106b-5p、miR-125a-5p在THP-1細胞中為低表達。(2)成功構(gòu)建過表達mir慢病毒感染細胞,qPCR檢測過表達基因發(fā)現(xiàn)miR-106b-5p表達豐度是對照組NC的7.636倍,miR-125a-5p表達豐度是對照組NC的59621.539倍。(3)MTS活力檢測結(jié)果表明:與對照組NC相比,hsa-miR-125a-5p組的細胞增殖倍數(shù)發(fā)生了顯著的變化(P0.05),而hsa-miR-106b-5p的細胞增殖變化則不明顯。(4)CCK-8細胞毒性檢測表明:相比對照組NC,mir-125a-5p組在5天時的吸收率變化倍數(shù)有顯著變化。(5)通過PI-FACS細胞周期檢測提示miR-125a-5p-UP組處于S期的細胞數(shù)減少(P0.05),G2/M期的細胞數(shù)增多(P0.05),使細胞從S期到G2/M期進程加速,促進了細胞的增殖。(6)通過Annexin V-APC細胞凋亡檢測,相比對照組,mir-125a-5p組凋亡細胞數(shù)無顯著差異(P0.05)。(7)Luciferase檢測分析miRNA-125a-5p與靶基因IL16的3'UTR結(jié)合,抑制靶基因IL16的表達,miR-125a和其靶基因IL16存在直接調(diào)控關(guān)系。結(jié)論:1.miR-106b-5p,miR-125a-5p及miR-183-5p在COPD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,尤其miR-125a-5p和miR-106b-5p與COPD的疾病嚴重程度相關(guān)。2.miR-125a-5p在人THP-1單核細胞系中功能明顯,可促進單核巨噬系統(tǒng)的增殖,調(diào)控靶基因IL-16表達下調(diào),通過增強抗炎作用成為COPD的保護因子。3.miR-125a-5p可能成為COPD分級(嚴重程度)標志物及治療的新靶點。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R563.9
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
縮略詞表
前言
第一部分 COPD患者中miRNA分級標志物的篩選、驗證及GO、KEGG通路分析
    1 實驗材料與方法
        1.1 實驗材料
        1.2 實驗方法
        1.3 統(tǒng)計分析
    2 結(jié)果
        2.1 患者樣本的選擇
        2.2 患者樣本的miRNA提取及質(zhì)量鑒定
        2.3 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量及長度分析
        2.4 miRNA的差異分析
        2.5 miRNA表達譜GO富集分析
        2.6 KEGG通路分析
        2.7 qRT-PCR驗證
    3 討論
        3.1 miRNA的表達差異分析
        3.2 miRNA表達譜GO富集分析
        3.3 miRNA表達譜的KEGG通路分析
    4 結(jié)論
第二部分 候選microRNAs的功能分析
    1 實驗材料與方法
        1.1 實驗材料
        1.2 實驗方法
    2 實驗結(jié)果
        2.1 miRNA表達量的細胞水平驗證
        2.2 慢病毒感染細胞
        2.3 qPCR檢測過表達基因
        2.4 MTS細胞活力檢測
        2.5 CCK-8 細胞活力檢測
        2.6 PI-FACS細胞周期檢測
        2.7 Annexin V-APC細胞凋亡檢測
        2.8 Luciferase檢測
    3 討論
    4 結(jié)論
參考文獻
綜述
    參考文獻
附錄
致謝
在學(xué)期間參與的科研課題與研究成果
個人簡歷

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本文編號：2884795