發(fā)布時間：2020-11-17 14:14

　　 目的體外培養(yǎng)小鼠海馬神經干細胞(NSCs),明確干擾Olig2對MK-801處理后海馬NSCs增殖、分化及凋亡的影響,探究Olig2對MK-801干預后海馬神經發(fā)生的調控作用。方法選取24h以內的新生C57BL/6小鼠,分離提取海馬組織用來原代培養(yǎng)NSCs,采用免疫熒光染色進行細胞鑒定和純度鑒定。用200μM的MK-801處理NSCs 24h以建立細胞損傷模型,并在此基礎上進行Olig2-shRNA慢病毒感染,將NSCs分為4組:(1)MK-801+慢病毒干擾組[MK801+Olig2-shRNA組簡稱(M+O組)],(2)MK-801+慢病毒空載體組[MK-801+LV-EGFP簡稱(M+L組)],(3)MK-801組(簡稱M組),(4)空白對照組(簡稱Blank組)。采用Western blot檢測Olig2的表達,以確定Olig2-shRNA慢病毒載體是否構建成功。采用Western blot、Real-time PCR、免疫細胞化學技術檢測Nestin、Sox2、Ki67、S100β和NeuN的表達,以觀察NSCs的增殖和分化情況,用流式細胞術檢測NSCs凋亡情況。結果Western blot結果顯示,Olig2-shRNA1組可明顯降低Olig2的表達(P0.05);與M組相比較,M+O組中Olig2表達明顯降低(P0.05),NeuN、Sox2顯著升高(P0.05),M+L組和Blank組中Olig2、NeuN、Sox2的表達均無統(tǒng)計學差異(P0.05)。qRT-PCR結果顯示,與M組相比較,M+O組中Nestin和Ki67表達顯著升高(P0.05),Blank組Nestin表達量顯著升高(P0.05),M+L組與M組相比Nestin表達量無統(tǒng)計學差異(P0.05),M+L組和Blank組分別與M組相比,Ki67的表達均無統(tǒng)計學差異(P0.05),M+O組、M+L組和Blank組S100β均無統(tǒng)計學差異;免疫熒光結果顯示,與M組相比,M+O組Ki67表達顯著升高(P0.05),M+L組和Blank組Ki67表達無統(tǒng)計學差異(P0.05),M+O組、M+L組和Blank組S100β均無統(tǒng)計學差異;流式細胞技術結果顯示,M+O組早期凋亡和總凋亡率較M組的凋亡率均降低且有統(tǒng)計學差異(P0.05),晚期凋亡對比無明顯差異;M組較Blank組早期凋亡和總凋亡率升高且有統(tǒng)計學差異(P0.05)。結論1.經MK-801處理NSCs后其增殖能力下降,凋亡增加。2.低表達Olig2可促進精神分裂癥后NSCs的增殖、促進NSCs向神經元分化,減少細胞凋亡,增加海馬神經發(fā)生。
【學位單位】：寧夏醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R749.3
【部分圖文】：

1. 小鼠海馬 NSCs 培養(yǎng)及鑒定原代培養(yǎng) 24 h 后，在條件培養(yǎng)基培養(yǎng)下 NSCs 呈現懸浮狀態(tài)，圓形，形態(tài)規(guī)則且折光性良好并且未見明顯聚球情況，可見部分顏色灰暗、折光性差的壞死細胞和細胞碎片會沉入培養(yǎng)瓶底，繼續(xù)培養(yǎng) 1-2 天，可見有少數細胞聚集成細胞團狀，繼續(xù)培養(yǎng) 2-3 天可見細胞成桑葚狀聚集成球，這些克隆細胞球球體邊緣整齊，克隆球內細胞未見突起排列緊密，折光性良好，并且隨培養(yǎng)時間增加而體積變大。培養(yǎng)至第 6-8 天時，克隆球中間顏色加深表示細胞進入衰老狀態(tài)進行傳代處理。細胞傳代后，會繼續(xù)以單個懸浮細胞聚集成克隆球生長，傳代后，細胞貼壁狀態(tài)會減少，生長狀態(tài)一般會加快。選取第二代第 3 天使用免疫熒光標記法進行細胞鑒定。Nestin 標記海馬 NSCs，Nestin（red）和DAPI（blue）共表達。（圖 1）

圖 2 NSCs 克隆球消化為單細胞后的 Nestin 免疫熒光染色結果。A 表示 Nestin 標記 NSCs，呈現紅色B 表示 DAPI 染細胞核，呈現藍色，C 表示 Nestin 與 DAPI 共標記代表陽性細胞。Scale bar=50 μm3. Olig2 干擾慢病毒感染時間的確定對海馬 NSCs 分別進行 24 h、48 h、72 h 慢病毒感染處理，結果顯示：細胞的熒光強度隨感染時間的增加而增強，72 h 熒光強度最強。因此，后續(xù)實驗本實驗將海馬 NSC的感染時間確定為 72 h。（圖 3）

圖 2 NSCs 克隆球消化為單細胞后的 Nestin 免疫熒光染色結果。A 表示 Nestin 標記 NSCs，呈現紅色B 表示 DAPI 染細胞核，呈現藍色，C 表示 Nestin 與 DAPI 共標記代表陽性細胞。Scale bar=50 μm3. Olig2 干擾慢病毒感染時間的確定對海馬 NSCs 分別進行 24 h、48 h、72 h 慢病毒感染處理，結果顯示：細胞的熒光強度隨感染時間的增加而增強，72 h 熒光強度最強。因此，后續(xù)實驗本實驗將海馬 NS的感染時間確定為 72 h。（圖 3）
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本文編號：2887602