【摘要】：結直腸癌又稱為大腸癌(colorectal cancer,CRC),是全世界第三大常見癌癥。2014年美國新增CRC病例和CRC死亡的估計數(shù)分別約為135,000和50,000。早期診斷是結直腸癌最重要的預后影響因素,對于沒有局部或遠處轉移的早期疾病,5年存活率約為90%,但當存在遠處轉移時,存活率僅為10%。自20世紀80年代中期以來,與許多其他西方國家相比我國的結直腸癌發(fā)病率有所下降,尤其是晚期疾病。盡管造成這種下降的原因尚不清楚,但CRC篩查的推廣可能是一個重要因素。結直腸癌家族史,炎癥性腸病和罕見遺傳病例如家族性腺瘤性息肉病和Lynch綜合征使得個體患CRC的風險增加。但是在沒有任何這些已知風險因素的所謂平均風險人群中CRC發(fā)病率逐年增高。在一般人群中,年齡是CRC最重要的危險因素,90%以上的病例發(fā)生于50歲以上的個體。流行病學研究表明,生活方式的因素可能會影響CRC的發(fā)病風險,與風險增加有關的因素包括紅肉和加工肉類的高攝入量,吸煙,過度飲酒和肥胖,而體力活動和使用阿司匹林與CRC風險降低有關。由于缺乏CRC預防的明確方式,篩查是目前降低CRC負擔最廣泛也最易接受的方法。近年來,諸多研究者應用蛋白質組學等分子生物學技術針對結直腸癌的腫瘤標志物進行了研究,目前已知的相關的分子標志物例如:KRAS(抗EGFR抗體治療的預測標記物)、B-Raf V600E(抗EGFR抗體抗性的生物標志物)、PIK3CA、ERCC-1(奧沙利鉑的可能預測標志物)、PTEN(CRC患者無進展生存期較短相關)、COX-2、Ezrin。蛋白質組學的廣泛應用使得人們對腫瘤的了解逐步加深。本研究在收集了結直腸腺癌組織標本后,通過二維液相質譜色譜發(fā)分析結直腸腺癌組織及配對的癌旁組織,分析質譜數(shù)據(jù),建立差異表達蛋白質譜,本研究選取Cyp A作為目的蛋白,通過基因擴增、載體構建以期誘導表達融合蛋白,制備Cyp A單克隆抗體,并對抗體進行純化,鑒定;免疫組化驗證Cyp A在組織中的差異表達并分析Cyp A的表達與相關的病例參數(shù)之間的關系。本研究共分為四部分:第一部分結直腸癌與癌旁組織的差異蛋白質組學研究實驗方法:1.選擇20例確診為TNMIII期腺癌且并未進行治療的患的病變部位的癌組織樣本,及其附近10cm之外的癌旁組織。2.提取標本總蛋白,測定蛋白質濃度。3.制備蛋白水解多肽混合物。4.二維液相色譜法分離樣本。5.通過LTQ XL離子阱質譜儀對二維色譜洗脫的多肽進行檢測。6.對質譜數(shù)據(jù)進行生物信息學分析,找到癌組織與癌旁組織差異表達的蛋白質。結果:1、經分析,腫瘤組織中獲得了蛋白點357個;癌旁組織中蛋白質點獲得了243個。經比對,檢索,兩種組織中差異表達的蛋白質30個。2、上調表達蛋白(20個):Cyp A、ATP5B、TPM4、FGA、GSTP1、HIST1H3J、IGHA1、SERPINH1、TUBB3、IGHA1、TPM3、CKAP4、IGHA2、POSTN、FGB、FGG、PKM2、HIST1H2AE、MYH10和TUBB。3、下調表達蛋白(10個):SYNM、MYH11、PKM2、KRT10、FLNC、H2AFX、CAP1、MYL6、TUBB2A、TLN1。4、從差異表達蛋白譜中選取Cyp A為目標蛋白展開后續(xù)的研究。第二部分:Cyp A基因擴增、載體構建及誘導表達融合蛋白實驗方法:1.基于Gen Bank-nucleotide數(shù)據(jù)庫里面的Cyp A基因序列,完成Cyp A基因的擴增。2.連接Cyp A目的基因與p ET28a,構建原核表達載體,使BL21細胞發(fā)生轉變,由此獲取表達菌株BL21(7)DE3(8)(7)p ET28a/Cyp A(8)并誘導其表達。3.通過超聲讓菌體破碎,鎳瓊脂糖親和層析純化目的蛋白。4.SDS-PAGE檢測純化蛋白。5.Western bloting分析融合蛋白。實驗結果:1.順利創(chuàng)建p ET28a/Cyp A(原核表達質粒),經DNA測序,Gen Banknucleotide比對,明確其為目的序列。2.完成轉化、誘導表達、純化,SDS-PAGE及Western bloting鑒定環(huán)節(jié)工作后,得到純化目的蛋白。第三部分Cyp A單克隆抗體制備、純化、鑒定實驗方法:1.制備Cyp A蛋白免疫原,皮下注射免疫小鼠。取免疫小鼠脾臟,制備細胞,與骨髓瘤細胞融合。2.HAT選擇性培養(yǎng),ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞株;3.陽性雜交瘤細胞株腹水制備及腹水抗體效價檢測;4.親和層析法純化腹水中單克隆抗體;5.SDS-PAGE分析純化的單克隆抗體,常染色體染色分析雜交瘤細胞核型。實驗結果:1.得到1株穩(wěn)定分泌抗人Cyp A單克隆抗體的雜交瘤細胞株;2.抗體效價達1:160000,抗體純度達95%以上。第四部分Cyp A在組織中的差異表達及臨床病理參數(shù)分析實驗方法:1.收集30對結直腸癌組織及癌旁組織;2.根據(jù)病理診斷TNM分期將臨床病理資料分組;3.免疫組化法檢測Cyp A在結直腸癌組織和癌旁組織中的表達,并分析Cyp A表達與結直腸癌患者臨床參數(shù)的相關性。實驗結果:1.通過免疫組化觀察到結直腸癌組織和癌旁組織中均可檢測到Cyp A陽性表達,結直腸癌組織中表達率水平顯著高于癌旁組織。2.Cyp A蛋白陽性表達率與結直腸癌的腫瘤分化水平及淋巴結轉移有關:在腫瘤伴淋巴結轉移的腫瘤組織中Cyp A蛋白陽性表達率較高。通過以上研究,我們得出以下結論:1.本研究成功建立了結直腸癌組織與癌旁組織的差異蛋白譜。2.成功建立了Cyp A蛋白的雜交瘤細胞株,并進行了純化與鑒定;同時制備了Cyp A蛋白的單克隆抗體,從而為后續(xù)的研究做好充分的準備工作。3.驗證了結直腸癌組織中Cyp A的表達量顯著高于癌旁組織。4.分析了Cyp A蛋白與腫瘤淋巴結轉移、TNM分期的關系,為判斷結直腸癌疾病的發(fā)展提供了潛在的依據(jù)。
【圖文】：

CYPA蛋白的質譜鑒定:AGPNTNGSQFFIC}CAM}TAK序列膚段的串聯(lián)質譜圖

CYPA蛋白的質譜鑒定:EGMNIVEAMER序列膚段的串聯(lián)質譜圖
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.34

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 Woo-Jeong Jeong;Pu-Hyeon Cha;Kang-Yell Choi;;Strategies to overcome resistance to epidermal growth factor receptor monoclonal antibody therapy in metastatic colorectal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2014年29期

2 ;Next generation of antibody therapy for cancer[J];癌癥;2011年05期

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本文編號：2649005