【目的】驗(yàn)證牛支原體P48蛋白在細(xì)胞中的位置,并為后續(xù)功能的研究奠定基礎(chǔ).【方法】運(yùn)用Overlap PCR擴(kuò)增獲得點(diǎn)突變后的牛支原體武威分離株P(guān)48基因,并將其克隆至pGEM-T Easy,將測序正確的質(zhì)�？寺≈帘磉_(dá)載體pET-28a中,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-P48,表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),并在IPTG誘導(dǎo)下成功獲得融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物rMbP48,大小約為51ku.重組蛋白純化后免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體.在分離牛支原體膜蛋白的基礎(chǔ)上應(yīng)用Western-blot及間接ELISA對(duì)P48蛋白在細(xì)胞中的分布進(jìn)行分析.【結(jié)果】P48蛋白主要存在于牛支原體的膜分離相.全菌免疫熒光試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)脂蛋白P48位于牛支原體的膜表面.【結(jié)論】牛支原體P48蛋白是存在于牛支原體表面的一種具有免疫原性的脂蛋白.本研究為進(jìn)一步研究P48蛋白的生物學(xué)特性及建立高效的牛支原體診斷方法奠定了基礎(chǔ).
【部分圖文】：

第２期胡國明等：牛支原體武威株脂蛋白Ｐ４８基因的克壟原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位并連接轉(zhuǎn)化，陽性質(zhì)粒酶切鑒定并測序，鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為ｐＥＴ－Ｐ４８（圖２）．Ｍ：ＤＮＡ分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；１：牛支原體武威株Ｐ４８基因．圖１牛支原體Ｐ４８基因的ＰＣＲ鑒定Ｆｉｇ．１ＰＣＲｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰ４８ｇｅｎｅｆｒｏｍｍｙｃｏｐｌａｓｍａｂｏｖｉｓＭ：ＤＮＡ分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；１：ｐＥＴ－Ｐ４８酶切鑒定．圖２重組質(zhì)粒ｐＥＴ－Ｐ４８的酶切鑒定Ｆｉｇ．２ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＥＴ－Ｐ４８２．２序列分析牛支原體武威分離株Ｐ４８基因在ＮＣＢＩ中的ＢＬＡＳＴ檢測結(jié)果顯示，該基因在牛支原體ＨＢ０８０１株、Ｈｕｂｅｉ－１株、ＰＧ４５株及ＣＱ－Ｗ７０株中均存在，且所有分離株的Ｐ４８基因序列同源性為１００％．Ｐ４８基因與無乳支原體的某些基因亦有很高的同源性，其中與Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅＰＧ２（ＩＤ：ＣＵ１７９６８０．１）、Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅｐ４８ａｎｄｐ５９ｇｅｎｅｓ（ＩＤ：ＡＪ１３２４２３．１）、Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ５６３２（ＩＤ：ＦＰ６７１１３８．１），同源性均達(dá)到８０％（表３），且上述３個(gè)基因與牛支原體Ｐ４８基因相比均存在兩處共９個(gè)堿基的缺失．雖然牛支原體Ｐ４８基因與無乳支原體上述３個(gè)基因具有較高的同源性，但與無乳支原體其他菌株序列具有較大差異，遺傳距離較遠(yuǎn)（圖３）．除此之外，在其他種屬支原體基因組中均未

第２期胡國明等：牛支原體武威株脂蛋白Ｐ４８基因的克壟原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位并連接轉(zhuǎn)化，陽性質(zhì)粒酶切鑒定并測序，鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為ｐＥＴ－Ｐ４８（圖２）．Ｍ：ＤＮＡ分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；１：牛支原體武威株Ｐ４８基因．圖１牛支原體Ｐ４８基因的ＰＣＲ鑒定Ｆｉｇ．１ＰＣＲｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰ４８ｇｅｎｅｆｒｏｍｍｙｃｏｐｌａｓｍａｂｏｖｉｓＭ：ＤＮＡ分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；１：ｐＥＴ－Ｐ４８酶切鑒定．圖２重組質(zhì)粒ｐＥＴ－Ｐ４８的酶切鑒定Ｆｉｇ．２ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＥＴ－Ｐ４８２．２序列分析牛支原體武威分離株Ｐ４８基因在ＮＣＢＩ中的ＢＬＡＳＴ檢測結(jié)果顯示，該基因在牛支原體ＨＢ０８０１株、Ｈｕｂｅｉ－１株、ＰＧ４５株及ＣＱ－Ｗ７０株中均存在，且所有分離株的Ｐ４８基因序列同源性為１００％．Ｐ４８基因與無乳支原體的某些基因亦有很高的同源性，其中與Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅＰＧ２（ＩＤ：ＣＵ１７９６８０．１）、Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅｐ４８ａｎｄｐ５９ｇｅｎｅｓ（ＩＤ：ＡＪ１３２４２３．１）、Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ５６３２（ＩＤ：ＦＰ６７１１３８．１），同源性均達(dá)到８０％（表３），且上述３個(gè)基因與牛支原體Ｐ４８基因相比均存在兩處共９個(gè)堿基的缺失．雖然牛支原體Ｐ４８基因與無乳支原體上述３個(gè)基因具有較高的同源性，但與無乳支原體其他菌株序列具有較大差異，遺傳距離較遠(yuǎn)（圖３）．除此之外，在其他種屬支原體基因組中均未

；２：ＣＱ－Ｗ０７；３：ＨＢ０８０１；４：Ｈｕｂｅｉ－１；５：Ｍａ５６３２；６：ＭａＰ４８ａｎｄＰ５９；７：ＭａＰＧ２；８：ＭａｓｔｒａｉｎＰＫ０１ＡＲＰ４８ｇｅｎｅ；９：ＭａｓｔｒａｉｎＲＬ１４／９５－９６Ｐ４８ｇｅｎｅ；１０：Ｐ４８ｇｅｎｅ；１１：Ｍａｓｔｒａｉｎ１７／９５－９５Ｐ４８ｇｅｎｅ；１２：ＭａｓｔｒａｉｎＶＰ１２／０５Ｐ４８ｇｅｎｅ．Ｍ：ＤＮＡ分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；１：ｐＥＴ－Ｐ４８酶切鑒定．圖３Ｐ４８基因核苷酸進(jìn)化樹分析Ｆｉｇ．３ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰ４８ｇｅｎｅ２．３重組蛋白的表達(dá)將重組表達(dá)質(zhì)粒ｐＥＴ－Ｐ４８轉(zhuǎn)入大腸桿菌ＢＬ２１（ＤＥ３），經(jīng)終濃度為１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ誘導(dǎo)，獲得重組蛋白的可溶性表達(dá)產(chǎn)物與預(yù)期一致，其分子量大小約為５１ｋｕ（圖４）．２．４兔抗ｒＭｂＦ８多抗的制備及Ｐ４８的亞細(xì)胞定位采集Ｐ４８重組蛋白４免后的新西蘭大白兔血液分離血清，所得多克隆抗體效價(jià)高達(dá)１∶２５６００．牛支原體胞漿蛋白、膜蛋白Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ檢測結(jié)果顯示，牛支原體Ｐ４８蛋白絕大部分存在于外膜（圖５）．ＥＬＩＳＡ結(jié)果進(jìn)一步證明牛支原體Ｐ４８蛋白在膜表面所占比例遠(yuǎn)大于胞漿蛋白（圖６）．免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示，抗ｒＭｂＦ４８重組蛋白多克隆抗體處理的支原體表面可結(jié)合熒光標(biāo)記的二抗，從而可見明顯的熒光，而陰性血清處理的牛支原５

本文編號(hào)：2893826