發(fā)布時間：2020-12-15 19:02

　　衰老是植物生長發(fā)育的重要生命過程,通過衰老的發(fā)生,植物可以自我保護和抵抗不良外界環(huán)境。衰老的調控機制非常復雜,而早衰突變體的發(fā)現為人們研究衰老的機制提供了理想的工具。本實驗室在研究白樺（Betula platyphylla×B.pendula）BpGH3.5基因時,獲得了 21個超表達株系,其中有一個株系葉片表面逐漸長有褐色的斑點,葉片提前脫落,表現為早衰的表型,命名為lmd（Lesion mimic and defoliation）株系。選取突變株系lmd、轉基因對照G21株系、野生型對照WT株系進行了植株生長、光合生理、細胞結構、組織化學染色、相關酶類活性變化、抗病性等方面的研究。實驗結果表明,lmd株系的株高、地徑和凈光合速率均顯著低于兩個對照株系,而其他的光合指標和葉綠素熒光參數與兩個對照株系相比并無顯著差別。實體顯微鏡觀察發(fā)現lmd株系第4葉開始,葉片表面出現褐色斑點,并且斑點的數目隨著葉齡的增加而逐漸增加,但其大小并未發(fā)生改變。石蠟切片結果表明褐色斑點處的細胞已經死亡,Evans blue染色結果表明lmd株系葉片死亡細胞數目顯著多于兩個對照。細胞超微結構觀察發(fā)現lmd株系... 

【文章來源】：東北林業(yè)大學黑龍江省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數】：117 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒論
    1.1 影響植物葉片衰老的因素
        1.1.1 葉片衰老的外部因素
        1.1.2 葉片衰老的內部因素
    1.2 植物衰老的生理生化變化
    1.3 植物衰老的分子機理
        1.3.1 葉片衰老的多水平調控
        1.3.2 植物衰老相關基因
    1.4 EIN3/EILs轉錄因子家族研究進展
        1.4.1 EIN3/EILs參與乙烯信號轉導
        1.4.2 EIN3/EILs與植物的抗逆性有關
        1.4.3 EIN3/EILs調節(jié)乙烯與其它激素的交叉對話
    1.5 本研究的目的與意義
2 白樺早衰突變體的特征
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 供試菌種
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要儀器設備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 株高和地徑的調查
        2.2.2 光合速率和葉綠素熒光參數的測定
        2.2.3 葉片表面超微結構的觀察
        2.2.4 石蠟切片的制備與觀察
        2.2.5 葉片超微結構的觀察
        2.2.6 組織化學染色
        2.2.7 POD、SOD及MDA的測定
        2.2.8 抗病性觀察
    2.3 實驗結果
        2.3.1 lmd、G21、WT株系生長性狀比較
        2.3.2 lmd、G21、WT株系光合特性和葉綠素熒光參數比較
        2.3.3 lwd、G21、WT株系葉片表面超微結構觀察
        2.3.4 lmd、G21、WT株系葉片組織解剖結構的觀察
        2.3.5 lmd、G21、WT株系葉片超微結構觀察
        2.3.6 組織化學染色
        2.3.7 POD、SOD、MDA測定
        2.3.8 lmd、G21、WT株系抗病性分析
    2.4 本章小結
3 白樺早衰形成相關基因表達的分析
    3.1 實驗材料
    3.2 實驗方法
        3.2.1 RNA的提取與反轉錄
        3.2.2 RNA文庫的構建及測序
        3.2.3 轉錄組文庫質量評估
        3.2.4 基因表達量及差異基因分析
        3.2.5 qRT-PCT方法驗證表達譜測序結果
        3.2.6 內源激素含量的測定
    3.3 實驗結果
        3.3.1 RNA的獲得
        3.3.2 測序數據統(tǒng)計與評估
        3.3.3 轉錄組測序文庫質量評估
        3.3.4 差異表達基因數目統(tǒng)計
        3.3.5 lmd、G21和WT 3個株系功能葉片差異基因分析
        3.3.6 基因共表達分析
        3.3.7 qRT-PCR驗證
        3.3.8 lmd突變株早衰分子機制分析
    3.4 本章小結
4 T-DNA插入位點側翼序列分析
    4.1 實驗材料
    4.2 實驗方法
        4.2.1 白樺總DNA的提取
        4.2.2 Southern雜交
        4.2.3 早衰突變體lmd基因組重測序
        4.2.4 TAIL-PCR
        4.2.5 插入位點的驗證
    4.3 實驗結果
        4.3.1 白樺總DNA的獲得
        4.3.2 T-DNA插入位點數的確定
        4.3.3 lmd突變株基因組重測序分析
        4.3.4 T-DNA插入位點的側翼序列的獲得
        4.3.5 插入位點的驗證
    4.4 本章小結
5 白樺BpEIN3基因功能初步研究
    5.1 實驗材料
        5.1.1 植物材料
        5.1.2 載體與菌株
    5.2 實驗方法
        5.2.1 BpEIN3啟動子的生物信息學分析
        5.2.2 BpEIN3啟動子的克隆及表達載體構建
        5.2.3 BpEIN3基因克隆及過表達載體構建
        5.2.4 BpEIN3基因抑制表達載體構建
        5.2.5 工程菌的制備及遺傳轉化
        5.2.6 轉基因植株的PCR檢測及基因定量分析
        5.2.7 BpEIN3啟動子的活性分析
        5.2.8 轉基因植株的表型觀察
    5.3 結果與分析
        5.3.1 BpEIN3啟動子序列順式作用元件分析
        5.3.2 BpEIN3啟動子的克隆及表達載體構建
        5.3.3 BpEIN3基因的克隆及表達載體構建
        5.3.4 BpEIN3基因抑制表達載體構建
        5.3.5 轉基因植株的PCR及qRT-PCR檢測
        5.3.6 BpEIN3啟動子的活性分析
        5.3.7 轉基因植株的表型觀察
    5.4 本章小結
6 討論與結論
    6.1 討論
        6.1.1 植物葉片衰老與細胞程序性死亡
        6.1.2 植物葉片早衰與抗病性的關系
        6.1.3 植物葉片衰老與基因表達
        6.1.4 植物EIN3基因在衰老和類病斑形成中的調控機制
    6.2 結論
    6.3 展望
參考文獻
附錄
攻讀學位期間發(fā)表的學術論文
致謝
附件


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：2918756