藏羊是我國典型的粗毛羊品種,其羊毛以初級毛囊形成的髓狀毛為主,是優(yōu)質的地毯毛來源,目前關于地毯毛性狀的遺傳機制報道較少。胚胎發(fā)育過程中,表皮細胞與真皮細胞的信號分子之間相互作用,誘導皮膚細胞增殖分化形成初級毛囊。分析藏羊初級毛囊誘導形成過程中的分子調控網絡,篩選參與調控初級毛囊誘導形成的關鍵基因,挖掘地毯毛性狀相關的種質資源,對提高羊毛品質具有重要意義。本研究通過轉錄組測序分析藏羊初級毛囊發(fā)育誘導期的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）和信使RNA（messenger RNA,mRNA）的分子調控網絡,解析初級毛囊早期發(fā)育過程中相互作用的關鍵激活因子EDAR和抑制因子BMP4的轉錄調控機制,闡明其誘導藏羊初級毛囊形成的潛在分子機制。具體結果如下:1.藏羊初級毛囊發(fā)育誘導期關鍵lncRNAs和mRNAs的篩選和鑒定通過組織形態(tài)學分析藏羊胚胎的皮膚結構發(fā)現(xiàn)初級毛囊誘導形成時期（stage 1）相比于誘導形成前時期（stage 0）,皮膚的表皮和真皮明顯增厚,并形成毛囊基板和真皮凝集體。通過分析藏羊初級毛囊誘導形成前后皮膚轉錄組測序數(shù)據鑒定到36個顯著上調的...

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 綜述
    1 前言
    2 毛囊的發(fā)育及其分期
    3 調控毛囊發(fā)育的關鍵信號通路
        3.1 WNT信號通路在毛囊發(fā)育中的研究進展
        3.2 EDAR信號通路在毛囊發(fā)育中的研究進展
        3.3 BMP信號通路在毛囊發(fā)育中的研究進展
        3.4 FGF信號通路在毛囊發(fā)育中的研究進展
        3.5 初級毛囊發(fā)育誘導期EDAR和 BMPs的互作
    4 非編碼RNA在毛囊發(fā)育中的研究進展
        4.1 miRNA在毛囊發(fā)育中的研究進展
        4.2 LncRNA在毛囊發(fā)育中的研究進展
    5 基因的轉錄調控機制
        5.1 啟動子區(qū)的轉錄調控
        5.2 miRNA對基因的轉錄后調控作用
    6 研究目的和意義
第二章 材料與方法
    1 試驗材料
        1.1 試驗樣品
        1.2 主要儀器與設備
        1.3 主要試劑和試劑盒
        1.4 主要試劑配制
        1.5 細胞系和載體
        1.6 主要的生物信息學網站和分析軟件
    2 試驗方法
        2.1 皮膚形態(tài)學分析
            2.1.1 石蠟切片
            2.1.2 蘇木精&伊紅(Hematoxylin and eosin,H&E)染色
        2.2 總RNA提取和c DNA合成
            2.2.1 總RNA提取
            2.2.2 cDNA反轉錄
        2.3 基因組DNA的提取
        2.4 轉錄組測序和生物信息學分析
            2.4.1 RNA質量檢測、cDNA文庫構建和測序
            2.4.2 測序數(shù)據質量檢測和序列比對組裝
            2.4.3 LncRNA的篩選和鑒定
            2.4.4 LncRNA與mRNA的結構比較
            2.4.5 LncRNA和mRNA的表達水平分析
            2.4.6 LncRNA靶基因預測
            2.4.7 LncRNA和 mRNA的功能富集分析
            2.4.8 互作網絡分析
        2.5 qRT-PCR
        2.6 切片原位雜交
            2.6.1 候選lncRNA的克隆
            2.6.2 原位雜交探針制備
            2.6.3 切片原位雜交
        2.7 候選基因啟動子缺失載體的構建
        2.8 候選基因啟動子活性分析
            2.8.1 細胞的復蘇、培養(yǎng)、凍存和轉染
            2.8.2 雙熒光素酶活性的檢測
        2.9 候選基因核心啟動子的轉錄因子結合位點預測
        2.10 轉錄因子結合位點突變載體的構建
        2.11 轉錄因子結合位點突變載體的雙熒光素酶活性檢測
        2.12 轉錄因子超表達載體的構建
        2.13 核心啟動子區(qū)質粒與轉錄因子超表達質粒共轉染細胞
        2.14 轉錄因子的超表達
        2.15 與候選基因3’UTR結合的miRNA預測
        2.16 候選基因3’UTR雙熒光素酶報告載體的構建
        2.17 候選基因3’UTR突變型雙熒光素酶報告載體的構建
        2.18 miRNA與候選基因結合位點的驗證
        2.19 miRNA對候選基因表達水平的影響
第三章 結果與分析
    1 藏羊初級毛囊發(fā)育誘導期關鍵lncRNAs、mRNAs的篩選和鑒定
        1.1 藏羊初級毛囊發(fā)育誘導期皮膚形態(tài)學分析
        1.2 藏羊初級毛囊發(fā)育誘導期皮膚轉錄組測序和生物信息學分析
            1.2.1 測序數(shù)據質量
            1.2.2 參考序列比對
            1.2.3 樣品間相關性分析
            1.2.4 候選lncRNAs和mRNAs的篩選
            1.2.5 LncRNAs與mRNAs的結構比較
            1.2.6 差異表達lncRNAs與mRNAs的鑒定
            1.2.7 差異表達lncRNAs靶基因與差異表達mRNAs GO分析
            1.2.8 差異表達lncRNAs靶基因與差異表達mRNAs KEGG分析
            1.2.9 差異表達mRNA-mRNA、lncRNA-mRNA的互作網絡分析
        1.3 qRT-PCR檢測藏羊初級毛囊發(fā)育誘導期關鍵lncRNAs的表達水平
        1.4 切片原位雜交檢測藏羊XLOC₂97809和XLOC₇64219的表達
        1.5 qRT-PCR檢測藏羊初級毛囊發(fā)育誘導期關鍵基因的表達水平
            1.5.1 qRT-PCR檢測WNT信號通路中差異基因的表達水平
            1.5.2 qRT-PCR檢測EDAR信號通路中差異基因的表達水平
            1.5.3 qRT-PCR檢測BMP信號通路中差異基因的表達水平
            1.5.4 qRT-PCR檢測其它關鍵差異基因的表達水平
    2 藏羊EDAR基因的轉錄調控機制研究
        2.1 藏羊EDAR啟動子區(qū)的轉錄調控機制
            2.1.1 EDAR啟動子缺失載體構建
            2.1.2 EDAR啟動子活性分析
            2.1.3 EDAR啟動子進一步缺失載體構建
            2.1.4 EDAR啟動子活性進一步分析
            2.1.5 EDAR核心啟動子的轉錄因子結合位點預測
            2.1.6 EDAR核心啟動子的轉錄因子結合位點定點突變
            2.1.7 超表達ETS1對EDAR啟動子活性的影響
            2.1.8 超表達ETS1對EDAR基因表達水平的影響
        2.2 miRNA對藏羊EDAR基因表達的調控
            2.2.1 與EDAR基因3’UTR結合的miRNA預測
            2.2.2 miR-125a-5p和 miR-24-3p的成熟序列保守性分析
            2.2.3 EDAR基因3’UTR與miRNA的結合位點分析
            2.2.4 雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證
            2.2.5 miR-125a-5p對 EDAR基因表達水平的影響
    3 藏羊BMP4基因的轉錄調控機制研究
        3.1 藏羊BMP4啟動子區(qū)的轉錄調控機制
            3.1.1 BMP4啟動子缺失載體構建
            3.1.2 BMP4啟動子活性分析
            3.1.3 BMP4核心啟動子的轉錄因子結合位點預測
            3.1.4 BMP4核心啟動子的轉錄因子結合位點定點突變
            3.1.5 超表達MYC和SP1對BMP4啟動子活性的影響
            3.1.6 超表達MYC和SP1對BMP4基因表達水平的影響
        3.2 miRNA對藏羊BMP4基因表達的調控
            3.2.1 與BMP4基因3’UTR結合的miRNA預測
            3.2.2 miR-340-5p的成熟序列保守性分析
            3.2.3 BMP4 基因3’UTR與miRNA的結合位點分析
            3.2.4 雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證
            3.2.5 miR-340-5p對BMP4基因表達水平的影響
第四章 討論
    1 藏羊初級毛囊發(fā)育誘導期形態(tài)學分析
    2 調控藏羊初級毛囊誘導形成的關鍵mRNAs
    3 調控藏羊初級毛囊誘導形成的關鍵lncRNAs
    4 調控藏羊初級毛囊誘導形成的候選基因的選擇
    5 候選基因的轉錄調控機制研究
    6 調控藏羊初級毛囊誘導形成的候選lncRNAs、基因、轉錄因子和miRNAs
第五章 結論
    1 主要結論
    2 主要創(chuàng)新點
參考文獻
發(fā)表論文
致謝



本文編號：4025155