真核起始因子5A(eIF-5A)普遍存在于所有真核細(xì)胞內(nèi)，是目前發(fā)現(xiàn)唯一一個(gè)含有hypusine殘基的蛋白質(zhì)。本工作首先從Mo7e細(xì)胞中提取RNA，通過(guò)RT-PCR方法釣取eIF-5A，在確認(rèn)序列正確的基礎(chǔ)上，構(gòu)建eIF-5A的原核表達(dá)載體。誘導(dǎo)表達(dá)后，通過(guò)鈷離子柱進(jìn)行親和純化，然后通過(guò)免疫印記和肽質(zhì)量指紋譜方法對(duì)重組蛋白進(jìn)行鑒定，并用原子力顯微鏡對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析。用得到的重組蛋白分別免疫家兔和小鼠，獲得兔的抗血清和三株持續(xù)分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞株，為進(jìn)一步分析eIF-5A的功能提供了檢測(cè)手段。eIF-5A的hypusine修飾是其活性和功能發(fā)揮所必需的，我們通過(guò)PCR方法實(shí)現(xiàn)了hypusine位點(diǎn)的定點(diǎn)突變，并進(jìn)一步構(gòu)建了含GFP標(biāo)簽的eIF-5A及其hypusine位點(diǎn)突變的真核表達(dá)載體。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，eIF-5A表達(dá)初期為全細(xì)胞分布，而后逐漸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，表明其具有核質(zhì)穿梭功能。然后利用氨基酸突變、添加阻斷劑等方法，抑制eIF-5A的hypusine修飾，觀察到eIF-5A始終為全細(xì)胞分布，提示抑制hypusine的形成可影響eIF-5A的亞細(xì)胞定位，進(jìn)而影響其功能的發(fā)揮。進(jìn)一...

【文章頁(yè)數(shù)】：78 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
引言
第一部分 eIF-5A蛋白質(zhì)表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
    材料與方法
    結(jié)果與討論
    小結(jié)
第二部分 重組eIF-5A蛋白質(zhì)的原核表達(dá)和抗體制備
    材料與方法
    結(jié)果與討論
    小結(jié)
第三部分 eIF-5A的亞細(xì)胞定位及功能的初步研究
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    小結(jié)
總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄
    英文縮略詞
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