發(fā)布時間：2020-11-10 08:42

　　 豬圓環(huán)病毒病(Porcine circovirus disease,PCVD)是當(dāng)前我國廣泛流行的豬傳染性疾病,是由豬圓環(huán)病毒2型(Porcinecircovirustype2,PCV-2)引起的。其中斷奶仔豬最易感,臨床表現(xiàn)多以斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)為特點(diǎn),給我國乃至世界各國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。PCV-2引起的豬圓環(huán)病毒病目前尚無有效的治療措施,而且PCV-2對外界抵抗力強(qiáng),豬場凈化難度高。疫苗接種仍然當(dāng)前防控該病的最有效的手段之一。由于性能穩(wěn)定、安全性高,滅活疫苗是當(dāng)前主要的疫苗研發(fā)類型,雖然商業(yè)化的滅活疫苗已在世界各地養(yǎng)殖場廣泛的應(yīng)用,但其綜合免疫效果仍有待提高。本研究首先對PCV-2YZ分離株的繁殖滴度、特異性、毒力、免疫原性等生物學(xué)特性進(jìn)行評價;隨后確立了豬圓環(huán)病毒2型YZ株的最佳細(xì)胞培養(yǎng)條件;進(jìn)一步建立了 PCV-2YZ株的種子批并完成了各項(xiàng)鑒定;最后篩選和優(yōu)化疫苗劑型和免疫佐劑,為研制出安全高效的PCV-2滅活疫苗奠定了基礎(chǔ)。1.豬圓環(huán)病毒2型YZ株生物學(xué)特性研究為研究PCV-2 F1代病毒的生物學(xué)特性,采用間接免疫熒光法(Indirect fluorescence assay,IFA)測定病毒繁殖滴度,中和試驗(yàn)測定病毒特異性,PCR方法和免疫組化(immunohistochemistry,IHC)試驗(yàn)測定病毒感染的毒力,進(jìn)一步通過免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)評價該毒株的免疫原性。結(jié)果顯示:PCV-2YZ株F1代病毒效價為105.48TCID50/ml,并可與PCV-2陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng),中和后感染細(xì)胞未見熒光:用F1代病毒對3～5周齡健康易感仔豬肌肉注射和滴鼻病毒液各2.0 ml/頭,可使仔豬(5/5)全部發(fā)病,出現(xiàn)典型的PCV-2感染相關(guān)臨床癥狀及病理變化;將PCV-2F1代毒株制備滅活疫苗,并對健康仔豬(3～5周齡)進(jìn)行免疫,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在二免后2 w,該疫苗不僅能提高仔豬體液免疫水平,誘導(dǎo)高效特異性抗體產(chǎn)生,而且能夠有效抵抗3株不同來源流行株的攻擊,保護(hù)率可達(dá)100%。以上試驗(yàn)結(jié)果表明:PCV-2YZ株F1代各項(xiàng)生物學(xué)特性穩(wěn)定,而且該侯選株對目前的流行毒株具有良好的保護(hù)效力,可以作為疫苗株開展進(jìn)一步的應(yīng)用。2.豬圓環(huán)病毒2型YZ株最佳培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)通過對D-氨基葡萄糖濃度、接毒時細(xì)胞密度、接種方式、接毒劑量、收毒時間以及收毒方法等一系列條件進(jìn)行優(yōu)化,采用間接免疫熒光方法檢測病毒滴度,篩選出最佳PCV-2增殖條件。結(jié)果顯示:以2-4 mmol/LD-氨基葡萄糖加入維持液,待細(xì)胞長至單層后按培養(yǎng)液10%的量接毒,37℃培養(yǎng)72 h,細(xì)胞及細(xì)胞液一起反復(fù)凍融后收獲,獲得的病毒滴度高,能達(dá)到105.50 TCID50/ml以上。采用上述最優(yōu)培養(yǎng)條件分別在扁瓶和轉(zhuǎn)瓶上對PCV-2的培養(yǎng)進(jìn)行驗(yàn)證,取PCV-2 YZ株F1代病毒連續(xù)傳5代后分別測其毒價,病毒含量仍不低于105.50 TCID50/ml,證明最佳培養(yǎng)條件可用于工廠化生產(chǎn)。3.豬圓環(huán)病毒2型YZ株種子批的建立及鑒定研究為了建立PCV-2(PCV-2)YZ株種子批,將PCV-2 YZ株F1代種毒,在PK-15細(xì)胞上連傳至30代后分別測定各代次病毒液的TCID50。經(jīng)測定各代次病毒液效價均穩(wěn)定在105.0 TCID50/ml以上,且無細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病毒污染;PCV-2陽性血清均能與PCV-2 YZ株F1、F10、F25、F30代病毒液發(fā)生較好的特異性中和反應(yīng);各代病毒液經(jīng)傳代后其免疫原性沒有發(fā)生改變,具有良好的穩(wěn)定性,根據(jù)以上結(jié)果確定PCV-2YZ株種毒基礎(chǔ)種子批代次為F21代～F25代;生產(chǎn)種子批代次為F26代～F28代,連續(xù)繼代不超過3代。選擇F5-F10代病毒液測定其毒力,以確立強(qiáng)毒標(biāo)準(zhǔn),同時對各代次病毒液的純凈性、特異性進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果顯示:F5-F8代病毒液具有較強(qiáng)的致病性,可導(dǎo)致4/5頭以上攻毒仔豬發(fā)病,而F9、F10代病毒液致病性則相對減弱,因此強(qiáng)毒代次定為F5-F8代。4.不同佐劑及劑型的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的制備及免疫效力評價選用不同免疫佐劑,同時配合不同劑型,制備PCV-2滅活疫苗(YZ株),隨后免疫仔豬后評價各疫苗的免疫效力。制備的滅活疫苗包括:選用10號白油制備油包水(W/O)劑型疫苗;選用ISA206VG佐劑(MontanideTM),制備水包油包水(W/O/W)劑型疫苗;分別選用ISA 15A VG和ISA35 VG佐劑(MontanideTM),制備水包油劑型(O/W)劑型疫苗;選用IMS251CVG佐劑(MontanideTM),制備水(W)劑型疫苗。除白油組外,其余4組疫苗安全性較好。5組疫苗免疫效力試驗(yàn)表明,ISA 206 VG(W/O/W)疫苗組首免后2 w和3wPCV-2IFA抗體水平顯著高于白油(W/O)和IMS251CVG(W)疫苗組(P0.05);攻毒后豬血清中病毒PCR檢測,ISA206VG(W/O/W)疫苗組14d均為陰性,其他免疫組21～28 d轉(zhuǎn)為陰性;豬淋巴結(jié)免疫組化檢測,ISA 206 VG(W/O/W)、ISA 15A VG(O/W)疫苗組均未出現(xiàn)PCV-2陽性,且該兩組中仔豬均未出現(xiàn)連續(xù)2d以上的高熱癥狀。以上結(jié)果表明,ISA206VG(W/O/W)PCV2滅活疫苗(YZ株)對仔豬具有較好的綜合免疫保護(hù)效力,可進(jìn)行后續(xù)的臨床擴(kuò)大試驗(yàn)。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

使遺傳物質(zhì)得到高效的利用，在ＰＣＶ－２的ＯＲＦｓ之間是表現(xiàn)為相互緊密的重疊排列［３５］。一??定程度上，ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ７、ＯＲＦ８之間的保守性較高，相比之下，??其余的ＯＲＦｓ保守性卻很低（如圖１）?％。通過分析ＰＣＶ－２的ＯＲＦｓ發(fā)現(xiàn)，其主要的閱讀??框分別是ＯＲＦ１和ＯＲＦ２，大小均＞６００?ｂｐ［３７］。此外，通過比較ＰＣＶ－１和ＰＣＶ－２的閱讀框發(fā)??現(xiàn)，二者的ＯＲＦ１相對較保守（核酸同源性為８３％；氨基酸同源性為８６％），而閱讀框ＯＲＦ２??

ＰＣＶ－２?ＹＺ株Ｆ１代病毒液可與ＰＣＶ－２陽性血清發(fā)生特異性中和反應(yīng)，其中病毒中和試??驗(yàn)組和培養(yǎng)基空白對照組在熒光顯微鏡下均未見熒光，而未中和的病毒對照組則在熒光顯??微鏡下觀察到綠色熒光信號，結(jié)果表明該病毒具有良好的特異性（表１－２，圖１－１）。??■■??圖１－１?ＰＣＶ－２?ＹＺ?Ｆ１代ＩＦＡ試驗(yàn)結(jié)果??（１）感染對照組（２）中和試驗(yàn)組??Ｆｉｇ?１－１?ＩＦＡ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＦＩ?ｖｉｒｕｓ?ｆｒｏｍ?ＰＣＶ－２?ＹＺ?ｓｔｒａｉｎ??（１）?Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｇｒｏｕｐ；?（２）?Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ?ｔｅｓｔ?ｇｒｏｕｐ??表１－２?ＰＣＶ－２?ＹＺ株ＦＩ代病毒特異性檢測結(jié)果??Ｔａｂｌｅ?１－２?Ｔｈｅ?ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ＦＩ?ｖｉｒｕｓ?ｏｆ?ＰＣＶ－２?ＹＺ?ｓｔｒａｉｎ??特異性（綠色熒光信號）??病毒?中和組?陽性組?陰性組??Ｆ１?＋??注：“＋”表示在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光信號表示在熒光顯微鏡下觀察不到綠色熒光信號??２．３毒力測定??２．３．１?ＰＣＶ－２陰性豬的篩選??３？５ｗ健康仔豬血清ＰＣＲ檢測為陰性（圖１－２），ＩＦＡ抗體檢測也為陰性（圖卜３）。??

?３１??清晰看不到黃染顆粒物質(zhì)（圖１－６）。健康對照組未見上述病理變化。??聲』々？心??腎贓病變，腎乳失出ｉ?髂內(nèi)汫巴結(jié)庚深、腫大?眄系巴結(jié)腫大、出血??ＳＭ攻毒后豬各器官病變情況?．１備??Ｆｉｇ?１－４．?Ｔｈｅ?ｌｅｓｉｏｎｓ?ｏｆ?ｏｒｇａｎｓ?ａｆｔｅｒ?ｃｈａｌｌｅｎｇｅ??—．１：４．?：??圖１－５攻毒豬淋巴結(jié)病理切片（４００ｘ）??Ｆｉｇ?１－５．Ｔｈｅ?ｐａｔｈ
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2877733