發(fā)布時(shí)間：2025-05-05 02:30

　　MiRNA是長(zhǎng)度為19-23nt的非編碼RNA序列，可通過與靶基因mRNA的3'UTR結(jié)合使其降解或抑制其翻譯。目前已有報(bào)道稱miRNA在細(xì)胞凋亡，癌癥發(fā)育，炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞增殖與分化中均有重要作用。MiR-15a/b家族龐大（多于十個(gè)成員），種子區(qū)域保守性好，在許多生理活動(dòng)中均有重要作用。為探明miR-15a/b對(duì)豬前體脂肪細(xì)胞發(fā)育的影響，通過實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了miR-15a/b在豬前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)圖譜，并構(gòu)建了miR-15a/b前體序列的腺病毒載體，用載體侵染原代細(xì)胞觀察miR-15a/b的超表達(dá)對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響。之后篩選miR-15a/b的靶基因并通過雙螢光素酶報(bào)告分析的方法鑒定靶基因的準(zhǔn)確性，主要研究結(jié)果如下： 1.檢測(cè)miR-15a/b在脂肪組織中的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-15a/b在脂肪分化前4天表達(dá)量較高，隨后表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，表明miR-15a/b可能在脂肪分化的初期起作用； 2.構(gòu)建miR-15a/b腺病毒超表達(dá)載體，經(jīng)過質(zhì)粒構(gòu)建、包裝、擴(kuò)繁和毒力測(cè)定后，高濃度的miR-15a/b腺病毒侵染豬原代脂肪細(xì)胞后，miR-15a表達(dá)量增加了2倍，miR-15b的表達(dá)量增加...

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    第一章 MiRNA 文獻(xiàn)綜述
        1.1 MiRNA 的發(fā)現(xiàn)歷史
        1.2 MiRNA 的生物合成，預(yù)測(cè)鑒定及靶基因篩選
            1.2.1 MiRNA 的生物合成
            1.2.2 MiRNA 的預(yù)測(cè)及鑒定
            1.2.3 MiRNA 靶基因的篩選
        1.3 MiRNA 在各領(lǐng)域的研究進(jìn)展
            1.3.1 MiRNA 對(duì)增殖分化（prolifeciation & differentation）的影響
            1.3.2 MiRNA 在免疫（immunization）調(diào)節(jié)中的作用
            1.3.3 MiRNA 在癌癥（cancer）及凋亡（apoptosis）過程中的作用
            1.3.4 MiRNA 在代謝（metabolism）調(diào)節(jié)中的作用
        1.4 MiRNA 研究展望
    第二章 MiR-15a/b 研究進(jìn)展
        2.1 MiR-15a/b 家族簡(jiǎn)介及其結(jié)構(gòu)
        2.2 MiR-15a/b 的研究進(jìn)展
        2.3 MiR-15a/b 與代謝相關(guān)的研究進(jìn)展
    第三章 FoxO1 研究進(jìn)展
        3.1 FoxO1 的簡(jiǎn)介
        3.2 FoxO1 對(duì)脂肪分化的影響
第二部分 實(shí)驗(yàn)研究
    第四章 MiR-15a/b 的保守性分析及表達(dá)譜的確定
        4.1 實(shí)驗(yàn)材料
            4.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.2 試驗(yàn)方法
            4.2.1 數(shù)據(jù)庫檢索 miR-15a/b 保守型
            4.2.2 豬原代脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)
            4.2.3 豬原代脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
            4.2.4 總 RNA 的提取
            4.2.5 RNA 的反轉(zhuǎn)錄
            4.2.6 實(shí)時(shí)定量
            4.2.7 數(shù)據(jù)分析
        4.3 結(jié)果與分析
            4.3.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果
            4.3.2 MiR-15a/b 在豬原代脂肪細(xì)胞成脂分化過程中的表達(dá)譜
        4.4 討論
    第五章 腺病毒構(gòu)建及侵染效果
        5.1 實(shí)驗(yàn)材料
            5.1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞株
            5.1.2 工具酶和其它試劑
        5.2 實(shí)驗(yàn)方法
            5.2.1 設(shè)計(jì) miR-15a/b 擴(kuò)增引物
            5.2.2 組織總 RNA 提取
            5.2.3 RNA 反轉(zhuǎn)錄 cDNA
            5.2.4 cDNA 擴(kuò)增 Pri-miR-15a/b 基因
            5.2.5 DNA 片段的回收
            5.2.6 DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備
            5.2.7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DH5α感受態(tài)細(xì)胞
            5.2.8 質(zhì)粒的小量提取
            5.2.9 穿梭質(zhì)粒 pAdTrack-CMV-Pri-miR-15a/b 載體的構(gòu)建
            5.2.10 重組質(zhì)粒 pAd-Pri-miR-15a/b 的構(gòu)建
            5.2.11 pAd-Pri-miR-15a/b 的擴(kuò)繁、大量提取、線性化及純化
            5.2.12 腺病毒包裝、擴(kuò)繁、純化及毒力檢測(cè)
        5.3 結(jié)果與分析
            5.3.1 Pri-miR-15a/b 擴(kuò)增結(jié)果
            5.3.2 T 載體連接結(jié)果
            5.3.3 穿梭質(zhì)粒鑒定結(jié)果
            5.3.4 重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果
            5.3.5 腺病毒包裝結(jié)果
            5.3.6 腺病毒 pAd-miR-15a/b 的擴(kuò)繁
            5.3.7 腺病毒 pAd-miR-15a/b 的毒力測(cè)定
        5.4 討論
    第六章 腺病毒 pAd-miR-15a/b 侵染豬原代脂肪細(xì)胞
        6.1 實(shí)驗(yàn)材料
            6.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞
            6.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        6.2 試驗(yàn)方法
            6.2.1 豬原代脂肪細(xì)胞分離步驟
            6.2.2 腺病毒侵染豬原代脂肪細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化
            6.2.3 豬前體脂肪細(xì)胞分化過程中成脂相關(guān)基因的 mRNA 及蛋白的檢測(cè)
            6.2.4 油紅 O 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂滴含量
            6.2.5 數(shù)據(jù)分析
        6.3 結(jié)果與分析
            6.3.1 腺病毒侵染效果及 miR-15a/b 超表達(dá)
            6.3.2 油紅 O 染色結(jié)果
            6.3.3 實(shí)時(shí)定量及 WB 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        6.4 討論
    第七章 MiR-15a/b 靶基因的篩選及潛在靶基因表達(dá)量的檢測(cè)
        7.1 實(shí)驗(yàn)材料
        7.2 實(shí)驗(yàn)方法
            7.2.1 生物信息學(xué)分析篩選靶基因
            7.2.2 檢測(cè)候選靶基因的 mRNA 表達(dá)水平
            7.2.3 檢測(cè)候選靶基因的蛋白表達(dá)水平
            7.2.4 數(shù)據(jù)分析
        7.3 結(jié)果與分析
            7.3.1 靶基因篩選結(jié)果
            7.3.2 候選靶基因 mRNA 表達(dá)量的檢測(cè)
        7.4 討論
    第八章 雙螢光素酶報(bào)告分析鑒定 miR-15a/b 靶基因
        8.1 實(shí)驗(yàn)材料
        8.2 試驗(yàn)方法
            8.2.1 雙螢光素酶載體 psiCHECK-2-IRS1 的構(gòu)建
            8.2.2 雙螢光素酶載體 psiCHECK-2- FoxO1 的構(gòu)建
            8.2.3 雙螢光素酶突變載體 psiCHECK-2-FoxO1-M 的構(gòu)建
            8.2.4 雙熒光素酶檢測(cè)
        8.3 結(jié)果與分析
            8.3.1 載體 psiCHECK-2-IRS1 的構(gòu)建及雙螢光素酶檢測(cè)結(jié)果
            8.3.2 載體 psiCHECK-2-FoxO1 和 psiCHECK-2-FoxO1-M 的構(gòu)建及雙螢光素酶檢測(cè)結(jié)果
        8.4 討論
結(jié)論
創(chuàng)新點(diǎn)
進(jìn)一步研究?jī)?nèi)容
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：4042983