C型產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens Type C）可感染豬、馬、牛、羊等各種家畜，3日齡內新生仔豬最易感，俗稱仔豬紅痢，病死率高，嚴重威脅我國的家畜養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌主要產(chǎn)生α、β1和β2三種毒素，其中α毒素具有細胞毒性、溶血性、致死性和皮膚壞死性等特性，是C型產(chǎn)氣莢膜梭菌一種重要的毒力因子。目前對于C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的紅痢的防治，主要采取的措施是給懷孕母豬于產(chǎn)前肌肉注射C型產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗，仔豬出生后喂食初乳，從而獲得被動免疫保護，同時與青霉素、土霉素等抗生素類藥物聯(lián)合使用，以達到治療的效果。臨床上對于抗體類藥物的使用較少，因為一般的抗體類藥物成本較高。近年來，卵黃抗體（IgY）通過口服等途徑來被動保護哺乳動物疾病的研究增加，由于禽類與哺乳動物物種距離較遠，對哺乳動物高保守蛋白具有強反應性，且IgY產(chǎn)量高，經(jīng)濟成本較低，制備簡單，因此在預防和治療哺乳動物消化道等疾病方面具有明顯的經(jīng)濟優(yōu)勢和廣闊的市場空間。本實驗對C型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素蛋白進行原核表達，生產(chǎn)抗α毒素的特異性IgY抗體，為以后臨床低成本抗體藥物的研制奠定基礎。研究內容分為以下3個部...

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【學位級別】：碩士

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摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌的生物學特點
        1.1.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌菌體形態(tài)特征
        1.1.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌菌體培養(yǎng)特征
        1.1.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌菌體的生化特征及抵抗力
    1.2 C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒力因子
        1.2.1 α毒素（CPA）
        1.2.2 β1 毒素（CPB1）
        1.2.3 β2 毒素（CPB2）和β2 毒素編碼基因（cpb2）
    1.3 C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病機理
        1.3.1 α毒素（CPA）的致病機理
        1.3.2 β1 毒素（CPB1）的致病機理和作用部位
    1.4 IgY 技術在畜禽胃腸道疾病中的應用
        1.4.1 IgY 用于防治幼畜細菌性和病毒性腹瀉
        1.4.2 IgY 用于防治禽細菌性和病毒性疾病
    1.5 本研究的目的及意義
第二章 C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素蛋白原核表達和純化
    2.1 材料
        2.1.1 菌株與載體
        2.1.2 工具酶和試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 所用溶液及培養(yǎng)基的配制
    2.2 方法
        2.2.1 C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組的提取
        2.2.2 引物設計與合成
        2.2.3 α毒素基因的 PCR 擴增
        2.2.4 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳
        2.2.5 重組 T-Vector pMD19-α的克隆
        2.2.6 重組 T-Vector pMD19-α的鑒定
        2.2.7 重組表達質粒 pET-32a-α的構建與鑒定
        2.2.8 pET-32a-α的 BL 21（DE3）表達菌的構建
        2.2.9 表達蛋白的 Western blot 分析
        2.2.10 包涵體蛋白的純化
        2.2.11 包涵體蛋白的復性
    2.3 結果與分析
        2.3.1 C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因的 PCR 擴增
        2.3.2 T-Vector pMD19-α的酶切鑒定
        2.3.3 重組表達質粒 pET-32a-α的構建及鑒定
        2.3.4 α毒素蛋白最佳誘導時間的確定
        2.3.5 α毒素蛋白 IPTG 誘導濃度的確定
        2.3.6 α毒素蛋白的 Western blot 分析
        2.3.7 α毒素重組蛋白的純化
        2.3.8 α毒素重組蛋白的復性
    2.4 討論
    2.5 小結
第三章 抗 C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素重組蛋白特異性 IgY 抗體的制備
    3.1 材料
        3.1.1 試劑
        3.1.2 溶液配制
    3.2 方法
        3.2.1 免疫原制備及免疫
        3.2.2 IgY 抗體提取和鑒定
        3.2.3 間接 ELISA 檢測 IgY 抗體效價
        3.2.4 IgY 抗體的 Western blot 鑒定
    3.3 結果與分析
        3.3.1 IgY 抗體的 SDS-PAGE 電泳
        3.3.2 抗體效價動態(tài)變化
        3.3.3 Western blot 鑒定
    3.4 討論
    3.5 小結
結論
參考文獻
致謝
作者簡介



本文編號：4044076