近年來(lái),CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)正迅速應(yīng)用于大基因組DNA病毒的編輯,尤其是一些致瘤性皰疹病毒。馬立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)屬于甲亞科皰疹病毒,血清I型MDV(MDV-1)感染自然宿主可誘導(dǎo)快速發(fā)作的T細(xì)胞淋巴瘤。meq基因是MDV-1致瘤的主要原癌基因,在馬立克病(Marek’s disease,MD)腫瘤發(fā)生中具有重要作用。本文以超強(qiáng)毒MDV(very virulent MDV,vvMDV)國(guó)際代表株Md5和我國(guó)分離株GX0101為研究對(duì)象,設(shè)計(jì)合成了多組meq基因特異性gRNA,利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功構(gòu)建了兩個(gè)meq基因缺失的毒株Md5△meq-C45和GX0101△meq-C56,并對(duì)病毒基因組相關(guān)區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序。結(jié)果證實(shí),meq基因被完全編輯并敲除。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(Indirect immunofluorescence assay,IFA)顯示,MEQ蛋白在兩個(gè)meq基因編輯毒株感染的CEF細(xì)胞中均無(wú)表達(dá),并且meq基因缺失經(jīng)連續(xù)15次傳代仍保持穩(wěn)定。通過(guò)熒光定量PCR(quantitative PCR,...

【文章頁(yè)數(shù)】：10 頁(yè)

【文章目錄】：
材料與方法
    1細(xì)胞、病毒、質(zhì)粒和抗體
    2主要試劑
    3 gRNA及引物的設(shè)計(jì)與合成
    4 pX459-gRNA質(zhì)粒構(gòu)建
    5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及病毒感染
    6 PCR分析gRNA編輯效果
    7 meq基因編輯病毒的克隆及純化
    8間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)（Indirectimmunofluorescence assay,IFA)
    9病毒增殖曲線測(cè)定
結(jié)果
    1 pX459-gRNA質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
    2 meq基因編輯及鑒定
    3 meq基因編輯病毒克隆純化及穩(wěn)定性分析
    4 meq基因編輯缺失毒株的IFA鑒定
    5 meq基因編輯缺失毒株的增殖曲線測(cè)定
討論



本文編號(hào)：4044953