【摘要】：目的惡性膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤,具有病程短、進展快、預后差等特點,目前的多種治療手段都無明顯的效果,嚴重威脅著人類的生命健康,2年生存率不足30%。最近腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)的發(fā)現(xiàn)為膠質(zhì)瘤的診斷和治療提供了新的策略與方向。研究發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤中存在著一群膠質(zhì)瘤干細胞(glioma stem cells,GSCs),雖然含量極少,卻具有無限增殖、自我更新、多向分化和重建腫瘤的能力,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、放化療抵抗和腫瘤復發(fā)相關(guān)。因此殺滅膠質(zhì)瘤干細胞可能成為治愈膠質(zhì)瘤的一種可行的手段。本課題組在前期蛋白組學研究中發(fā)現(xiàn)鈣結(jié)合蛋白S100A9在膠質(zhì)瘤干細胞中顯著上調(diào),靶向干擾S100A9后膠質(zhì)瘤增殖能力下降。S100A9蛋白屬鈣結(jié)合蛋白S100家族成員,廣泛參與細胞骨架構(gòu)建,鈣離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、分化及炎癥反應等,與腫瘤關(guān)系密切。本研究采用shRNA-S100A9慢病毒感染人U87膠質(zhì)瘤干細胞,觀察U87膠質(zhì)瘤干細胞增殖和自我更新能力,并揭示其作用的潛在機制。方法構(gòu)建沉默S100A9基因的質(zhì)粒(含S100A9基因沉默序列3個和陰性對照序列1個),采用三質(zhì)粒系統(tǒng)包裝沉默S100A9基因的慢病毒并感染人U87膠質(zhì)瘤干細胞。熒光顯微鏡觀察感染后細胞綠色熒光表達,嘌呤霉素對感染后的U87膠質(zhì)瘤干細胞進行篩選,獲取帶嘌呤霉素抗性細胞克隆進行培養(yǎng)。通過實時定量PCR技術(shù)(RT-qPCR)檢測S100A9mRNA的表達,免役印跡技術(shù)(Western blot)檢測S100A9蛋白的表達。本實驗分組如下:空白組、對照組、實驗組�？瞻捉M:未作任何處理的U87膠質(zhì)瘤干細胞,對照組:轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的U87膠質(zhì)瘤干細胞,實驗組:shRNA-S100A9-1、shRNA-S100A9-2、shRNA-S100A9-3。MTT法檢測細胞體外的增殖,干細胞成球?qū)嶒灆z測細胞自我更新能力,RT-qPCR和Western blot分別檢測β-catenin mRNA和蛋白的表達。結(jié)果慢病毒感染后實驗組U87膠質(zhì)瘤干細胞S100A9 mRNA和蛋白表達受到明顯抑制。與對照組比較:實驗組細胞增殖變慢(P0.05),干細胞成球能力受到明顯抑制(P0.05),β-catenin mRNA和蛋白的表達顯著下調(diào)(P0.05)。數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學意義。結(jié)論靶向干擾S100A9后能夠明顯抑制U87膠質(zhì)瘤干細胞的體外增殖、自我更新,其機制可能與抑制wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)導相關(guān),提示S100A9可能作為膠質(zhì)瘤治療的一個潛在靶點。
【圖文】：

C D圖 1 U87 膠質(zhì)瘤干細胞免疫熒光鑒定 100×(A:MERGE; B:DAPI; C:NESTIN; D:SOX-2)Fig. 1 Immunofluorescence Identification of U87 Glioma Stem Cells 100×(A:MERGE; B:DAPC:NESTIN; D:SOX-2)2.2 轉(zhuǎn)染后各組細胞熒光顯微鏡采圖（圖 2）

27D圖 2 慢病毒感染后各組細胞熒光表達 100×（A:sh-NC; B:shRNA-S100A9-1;C:shRNA-S100A9-2; D:shRNA-S100A9-3)Fig. 2 Cell fluorescence expression after lentivirus infection 100×（A:sh-NC;B:shRNA-S100A9-1; C:shRNA-S100A9-2; D:shRNA-S100A9-3)
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R739.4

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本文編號：2708989