隨著人們健康意識的提高,低聚果糖受到廣泛的關(guān)注。它是一種強效益生元,具有促進腸道菌群平衡,提高人體免疫力等多種生理功效,在食品領(lǐng)域中有重要的工業(yè)價值。內(nèi)切菊粉酶可以水解菊粉內(nèi)部的β-2,1糖苷鍵獲得低聚果糖。與傳統(tǒng)的利用果糖基轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)方法相比,該法操作簡單、副產(chǎn)物含量低、生產(chǎn)效率高。但目前內(nèi)切菊粉酶的來源十分有限,且存在產(chǎn)量低、酶學性質(zhì)不佳等問題,難以滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要。因此尋找多樣的微生物來源,從中獲得能夠高效、專一催化菊粉產(chǎn)生低聚果糖的新型內(nèi)切菊粉酶十分必要。本研究通過理性基因挖掘發(fā)現(xiàn)首個酵母來源的內(nèi)切菊粉酶基因,成功將其在大腸桿菌（Escherichia coli）中實現(xiàn)可溶性表達;將該酶分離純化后,探究其酶學性質(zhì)和水解產(chǎn)物;同時,通過發(fā)酵優(yōu)化提高其產(chǎn)量,通過分子對接建模和定點突變提高其催化活力。論文主要研究成果如下:1.內(nèi)切菊粉酶的基因挖掘和異源表達。通過理性基因挖掘獲得三段不同微生物來源的潛在內(nèi)切菊粉酶,通過酶活驗證得到Lipomyces starkeyi NRRL Y-11557唯一可能具有內(nèi)切菊粉酶活性,但產(chǎn)酶水平不高。對該酵母來源的潛在內(nèi)切菊粉酶基因序列inu3進行深...

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1-2內(nèi)切和外切菊粉酶的作用位點及產(chǎn)物

菊粉酶(inulinase)是一類作用于β-2,1糖苷鍵的水解酶,屬于糖苷水解酶(glycosidehydrolases,GH)第32家族。菊粉酶分為外切菊粉酶(exo-inulinase,EC3.2.1.80)和內(nèi)切菊粉酶(endo-inulinase,EC3.2.1.7....

圖1-3來自A.ficuum的內(nèi)切菊粉酶INU2的晶體結(jié)構(gòu)及其活性位點[48]

2012年,內(nèi)切菊粉酶晶體結(jié)構(gòu)首次成功解析[48],該蛋白來自A.ficuum,截至目前為止仍是唯一被解析的內(nèi)切菊粉酶晶體。內(nèi)切菊粉酶的三維結(jié)構(gòu)具有GH32家族的共同特點,如圖1-3所示:N端由5個葉片形成的封閉催化活性口袋,每個葉片包含4個反向平行的β-折疊片,形成經(jīng)典的“W”....

圖3-1潛在內(nèi)切菊粉酶的保守氨基酸序列比對

來源于A.ficuum[48](NCBI登錄號:O94220.1)、P.purpurogenum[60](NCBI登錄號:BAA12321.1)和Arthrobactersp.S37[61](NCBI登錄號:CAB63119.1)的內(nèi)切菊粉酶極具代表性,它們經(jīng)過實驗驗證并被很多....

圖3-2潛在內(nèi)切菊粉酶的系統(tǒng)發(fā)育分析

對這三株潛在內(nèi)切菊粉酶構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[55],如圖3-2所示。inu1與外切菊粉酶具有更近的進化距離,inu2和inu3與內(nèi)切菊粉酶具有更近的進化距離。其中,inu2來自T.devorans與細菌具有更近的進化距離,inu3來自L.starkeyiNRRLY-11557與霉菌....

本文編號：4047783