11α-羥基坎利酮是合成對心血管具有保護作用的依普利酮的醫(yī)藥中間體,是制備依普利酮的關鍵步驟。本實驗室分離獲得的一株赭曲霉MF016菌株中存在細胞色素P450(CYP)酶系統(tǒng),可轉(zhuǎn)化坎利酮生成11α-羥基坎利酮,但轉(zhuǎn)化率較低。且該酶菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物——赭曲霉毒素(OTA)具有強烈的肝臟和腎臟毒性以及潛在的致癌和突變能力,嚴重制約了其在制藥和食品等相關領域的應用。提高赭曲霉對甾體類藥物的催化效率一般需從發(fā)酵條件優(yōu)化和菌株改造兩個方面進行。目前,有關赭曲霉催化甾體類藥物發(fā)酵條件優(yōu)化的研究已有不少,但對赭曲霉菌株的定向改造報道不多見,而后者才是提高甾體催化效率的關鍵和技術難點。為了獲得一株高表達CYP單加氧酶而又失去產(chǎn)OTA能力的赭曲霉基因工程菌株,本研究利用測序平臺Pac Bio SMRT對赭曲霉MF016進行全基因組測序與注釋,獲得赭曲霉菌株MF016全基因組信息(Gen Bank No.VBTP00000000)。根據(jù)已報道的兩個與OTA合成相關的聚酮合酶基因(pks)序列信息,預測了赭曲霉MF016的兩個聚酮合酶基因pks1和pks2,并選擇pks2為待敲除基因。根據(jù)pks2序列設...

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖5.2 cypm的PCR產(chǎn)物電泳圖

將經(jīng)PCR驗證正確的菌株測序。測序結(jié)果經(jīng)Blast+分析顯示,與預測的cypm基因同源性為99.9%,序列大小為1834bp,共包含四個內(nèi)含子,編碼序列長1542bp,序列詳情見附錄6。綜上,成功獲得cypm基因并構(gòu)建了質(zhì)粒pMD18-Cyp。5.3.2cypm上游同源臂....

圖5.3 Up的PCR產(chǎn)物電泳圖

將PCR驗證正確的轉(zhuǎn)化子進行測序分析,結(jié)果顯示,與預測的序列同源性為99.9%,序列大小為1011bp,序列詳情見附錄7。綜上,成功獲得Up序列片段并構(gòu)建了質(zhì)粒pMD18-Up。5.3.3cypm下游同源臂序列的克隆及質(zhì)粒pMD18-Down的構(gòu)建

圖5.4 Down的PCR產(chǎn)物電泳圖

將PCR驗證正確的轉(zhuǎn)化子測序分析,結(jié)果顯示,與預測的序列同源性為99.9%,序列大小為610bp,序列詳情見附錄8。綜上,成功獲得Down序列片段并構(gòu)建了質(zhì)粒pMD18-Down。5.3.4Tr啟動子的克隆及質(zhì)粒pMD18-Tr的構(gòu)建

圖5.5 Tr啟動子的PCR產(chǎn)物電泳圖

將陽性轉(zhuǎn)化子測序分析,結(jié)果顯示,序列大小為359bp,與預測的序列同源性為99.8%,序列詳情見附錄9。綜上,成功獲得Tr啟動子并構(gòu)建了質(zhì)粒pMD18-Tr。5.3.5hyg基因的克隆及質(zhì)粒pMD18-Hyg的構(gòu)建

本文編號：4054905