人類活動使海洋環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)不斷增多,造成海洋微藻大量繁殖,形成有害藻類水華（Harmful Algae Blooms,HABs）。引發(fā)HABs的有害藻種使發(fā)生水域的生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞,嚴(yán)重影響沿海地區(qū)的經(jīng)濟發(fā)展,并且危害人類健康。因此,建立高效、準(zhǔn)確的產(chǎn)毒藻種的檢測方法在減少HABs的危害中起到重要的作用。本文建立了一種新型等溫擴增技術(shù)——雙探針滾環(huán)擴增技術(shù)（Double Probe Rolling Circle Amplification,dpRCA）,即將原有滾環(huán)擴增的一條鎖式探針改為兩部分,以提高反應(yīng)的特異性,并將該技術(shù)與橫向流動試紙條（Lateral Flow Dipstick,LFD）結(jié)合,探討其在海洋產(chǎn)毒藻類檢測中的應(yīng)用。分別以三種常見產(chǎn)毒微藻(海洋卡盾藻（Chattonella marina）、微小原甲藻（Prorocentrum minimum）以及強壯前溝藻（Amphidinium carterae）)的轉(zhuǎn)錄內(nèi)間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacers,ITS）作為目標(biāo)序列,對目標(biāo)序列進(jìn)行PCR擴增、克隆和測序,獲得它們的完整序列信息。對測序結(jié)果...

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1-1 dpRCA探針設(shè)計原理圖及探針與模板結(jié)合方式示意圖

雙探針滾環(huán)擴增技術(shù)(DoubleProbeRollingCircleAmplification,dpRCA)是為了提高特異性在RCA的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一種新型等溫擴增技術(shù)。與傳統(tǒng)的RCA只需一條鎖式探針不同,dpRCA主要依賴一條短探針(約18nt)和一條長探針(約58....

圖3-1目標(biāo)藻種基因組DNA瓊脂糖凝膠(1.0%)電泳圖

采用試劑盒法分別提取三種目標(biāo)微藻的基因組DNA,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3-1�？梢�,基因組DNA的電泳條帶均大于2000bp且較為清晰,可用作下一步實驗的模板。目標(biāo)藻中基因組DNA的濃度測定結(jié)果見表3-1。

圖3-2目標(biāo)藻種ITS序列的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳圖

采用通用引物對目標(biāo)藻種的ITS序列進(jìn)行PCR擴增,結(jié)果如圖3-2所示。從圖中可以看出,三種藻的基因組DNA均能成功擴增出長度在500bp–700bp的單一清晰條帶,可進(jìn)行下一步實驗。3.2.3目標(biāo)藻陽性克隆菌株的篩選

圖3-3三種目標(biāo)藻種克隆菌株菌落PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳圖片注:M,DL 1000 marker;泳道1-3:海洋卡盾藻,微小原甲藻,強壯前溝藻

對目標(biāo)藻種ITS序列PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收,回收產(chǎn)物與pMDTM18-T載體連接制備重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞,通過菌落PCR對克隆結(jié)果進(jìn)行驗證。菌落PCR結(jié)果如圖3-3,片段長度與之前的PCR擴增結(jié)果一致,可用于測序。3.2.4目標(biāo)序列的測序及比對結(jié)果

本文編號：4045468