本文旨在建立快速獲取豚鼠耳朵成纖維細(xì)胞的方法,為豚鼠體細(xì)胞重編程技術(shù)提供起始細(xì)胞。首先采用0. 05%Trypsin-EDTA和Collagenase IV兩種消化酶對(duì)脫毛后的耳朵組織碎塊進(jìn)行消化;然后對(duì)獲取的細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察,支原體檢測(cè),Vimentin蛋白免疫熒光鑒定,測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間;用綠色熒光蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染效率,核型鑒定檢測(cè)病毒對(duì)核型的影響。分離的豚鼠耳朵成纖維細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞,消化后2～3 h即大部分貼壁并基本完全伸展,細(xì)胞呈梭形或多角形,胞漿飽滿,立體感強(qiáng),細(xì)胞核清晰形態(tài)良好,支原體檢測(cè)陰性。細(xì)胞表達(dá)成纖維細(xì)胞特異性蛋白Vimentin。生長(zhǎng)曲線為S形,符合體外培養(yǎng)細(xì)胞正常生長(zhǎng)增殖規(guī)律,細(xì)胞倍增時(shí)間為24. 85 h。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染效率達(dá)75. 6%,病毒感染后染色體2n=64的細(xì)胞占90%,遺傳穩(wěn)定核型正常。本研究提供的體細(xì)胞獲取方法操作簡(jiǎn)單,效率高,獲取的細(xì)胞狀態(tài)良好,細(xì)胞增殖速度快,細(xì)胞感染率高,是一種非常合適的豚鼠耳朵成纖維細(xì)胞分離手段,為后續(xù)進(jìn)一步研究豚鼠體細(xì)胞重編程提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
    1.2 試劑
    1.3 原代豚鼠耳朵成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)
    1.4 支原體檢測(cè)
    1.5 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定
    1.6 免疫熒光
    1.7 病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及病毒感染
        1.7.1 磷酸鈣轉(zhuǎn)染法
        1.7.2 感染
    1.8 核型鑒定
    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
2 結(jié)果與分析
    2.1 豚鼠耳朵成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察
    2.2 豚鼠成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定
    2.3 豚鼠耳朵成纖維細(xì)胞Vimentin蛋白免疫熒光鑒定結(jié)果
    2.4 豚鼠耳朵成纖維細(xì)胞的GFP病毒感染
    2.5 豚鼠核型鑒定
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本文編號(hào)：4049572