發(fā)布時(shí)間：2020-09-05 06:54

　　 目的(1)探索左旋多巴(L-DOPA)作用于馬爾尼菲籃狀菌(Talaromyces marneffei,TM)后其產(chǎn)黑素的菌株較不產(chǎn)黑素的菌株蛋白表達(dá)有何差異。(2)對(duì)差異蛋白結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)的分析,了解差異蛋白所富集的主要生物學(xué)通路,對(duì)黑素產(chǎn)生時(shí)的細(xì)胞內(nèi)部生物學(xué)過程有初步的了解。(3)選取感興趣的差異蛋白點(diǎn)進(jìn)一步分析,希望發(fā)掘治療馬爾尼菲籃狀菌感染潛在的藥物治療靶點(diǎn)。方法(1)在含L-DOPA及不含L-DOPA的ANM固體培養(yǎng)基上避光培養(yǎng)Frr2161,37℃7天。(2)菌體蛋白通過Novagen的Yeast Buster proteins extraction reagent進(jìn)行提取,并用2-D Quant-kit試劑盒進(jìn)行蛋白定量。(3)利用雙向凝膠電泳分離總蛋白,銀染顯色后用ImageMaster 2D platinum 5.0分析軟件對(duì)膠圖進(jìn)行分析,找到差異蛋白點(diǎn)。(4)通過基質(zhì)輔助激光解析/電離-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF MS)獲取肽質(zhì)量指紋譜,利用MASCOT搜庫(UniProt數(shù)據(jù)庫)鑒定出差異蛋白點(diǎn)。(5)將鑒定出的差異蛋白進(jìn)行GO和pathway的分析。(6)利用RT-qPCR對(duì)感興趣的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。(7)在含格爾德霉素與不含格爾德霉素的BHI培養(yǎng)基上培養(yǎng)TM,通過肉眼、熒光顯微鏡及透射電鏡觀察格爾德霉素對(duì)TM有何影響。結(jié)果(1)經(jīng)雙向凝膠電泳分離總蛋白后總共得到38個(gè)差異蛋白點(diǎn),其中在產(chǎn)黑素的TM中高表達(dá)的蛋白點(diǎn)15個(gè),新出現(xiàn)的蛋白點(diǎn)16個(gè),低表達(dá)的蛋白點(diǎn)7個(gè)。(2)蛋白質(zhì)譜分析顯示差異蛋白組富集在HSP家族,尤其是HSP90。(3)RT-qPCR的結(jié)果顯示HSP90、HSP60、HSP70 mRNA水平在L-DOPA黑素化培養(yǎng)的TM中表達(dá)上調(diào),與蛋白組學(xué)比較結(jié)果一致。(4)GO分析提示熱休克蛋白家族富集在了絕大部分的生物學(xué)功能,熱休克蛋白主要富集在壓力應(yīng)激、細(xì)胞加工、蛋白質(zhì)折疊、生物學(xué)進(jìn)程、對(duì)刺激的反應(yīng)這幾條通路而這些通路同樣是差異蛋白富集較多的通路,pathway分析提示蛋白富集最多的是吞噬體這條通路。(5)在含格爾德霉素的BHI培養(yǎng)基上,肉眼見TM菌落生長受到抑制,黑素生成減少;熒光顯微鏡結(jié)果見TM形態(tài)有向菌絲相轉(zhuǎn)化的趨勢(shì),透射電鏡結(jié)果見菌體內(nèi)電子致密顆粒較不含格爾德霉素的對(duì)照組明顯減少,囊泡未見明顯擴(kuò)張,細(xì)胞壁破壞。結(jié)論:(1)熱休克蛋白家族尤其是HSP90在TM黑素產(chǎn)生過程中有著活躍的生物學(xué)活動(dòng)。(2)HSP90抑制劑對(duì)TM生長和黑素生成有抑制作用。(3)黑素的代謝通路與吞噬體通路密切相關(guān)。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R756
【部分圖文】：

馬爾尼菲籃狀菌多巴黑素生成調(diào)控的相關(guān)蛋白組學(xué)研究 2018 屆碩士學(xué)位論結(jié) 果1. ANM 培養(yǎng)基上 TM 的生長情況置于 37℃恒溫箱避光培養(yǎng) 7 天后,觀察菌落顏色的變化（圖 1），可見在不含 L-DOPA 的 ANM 培養(yǎng)基上，菌落呈乳白色酵母樣，培養(yǎng)基透明呈淡黃色未見色素（圖 3-1.a），而在含 L-DOPA 的 ANM 培養(yǎng)基上，菌落呈灰褐色酵母樣，培養(yǎng)基被染成黑色（圖 3-1.b）。

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本文編號(hào)：2812703