念珠菌是侵襲性真菌感染的最常見致病菌,單核-巨噬細胞是參與機體固有免疫反應的重要細胞。本文探討了巨噬細胞在機體針對念珠菌的免疫反應中所發(fā)揮的作用,主要分兩大部分。首先,通過建立小鼠腹腔白念珠菌感染模型,發(fā)現(xiàn)與其他免疫細胞相比,巨噬細胞吞噬白念珠菌的比例最高,說明在白念珠菌感染后巨噬細胞是持續(xù)存在的、最主要的吞噬細胞。通過為小鼠靜脈注射氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(Clodronate liposomes),建立清除巨噬細胞的小鼠模型,發(fā)現(xiàn)清除巨噬細胞的小鼠白念珠菌系統(tǒng)感染后體重明顯減輕,死亡率明顯增加,提示了巨噬細胞在抗念珠菌感染中的核心地位。樹突細胞相關C型凝集素1(Dectin-1)是一種能夠特異性識別白念珠菌胞壁成分β-葡聚糖的模式識別受體;通過轉(zhuǎn)染特異性siRNA的方法干擾Dectin-1受體的表達,給予熒光標記的白念珠菌孢子誘導THP-1巨噬樣細胞,以熒光顯微鏡、流式細胞儀兩種方法檢測對白念珠菌的吞噬情況,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA-Dectin-1后細胞對白念珠菌的吞噬水平明顯降低,說明Dectin-1受體在巨噬細胞對白念珠菌的吞噬效應中發(fā)揮重要作用。近些年來由非白念珠菌感染致病的情況逐漸增多,特別是近平滑念珠菌、熱帶念珠菌臨床致病較高;因此,本研究關注了近平滑念珠菌、熱帶念珠菌所誘導巨噬細胞的炎癥反應。THP-1巨噬樣細胞給予近平滑念珠菌、熱帶念珠菌體外誘導,通過q-PCR、ELISA兩種方法檢測,發(fā)現(xiàn)其均可誘導促炎癥因子(TNF-α、IL-6)表達及分泌水平的增加,并呈現(xiàn)劑量、時間依賴效應;通過western blotting、共聚焦顯微鏡證明p38MAPK、ERK1/2MAPK、NF-κB等信號分子被激活,且流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)Dectin-1受體表達上調(diào),證明其參與炎癥反應。本研究的第二部分關注了白念珠菌對巨噬細胞自噬的影響。以THP-1巨噬樣細胞、RAW 264.7細胞為研究對象,通過白念珠菌刺激聯(lián)合多種溶酶體抑制劑,包括E-64d+pepstatin、氯喹(CQ)、氯化銨(NH4Cl)及巴弗洛霉素-A1(BAF-A1),western blotting檢測發(fā)現(xiàn)白念珠菌可以降低LC3-I型向LC3-II型的轉(zhuǎn)換,丫啶橙(AO)染色熒光觀察發(fā)現(xiàn)白念珠菌的吞噬使巨噬細胞內(nèi)自噬溶酶體的形成減少,說明白念珠菌感染降低巨噬細胞的基礎自噬流水平。同時,通過轉(zhuǎn)染GFP-LC3、RFP-GFP-LC3桿狀病毒來熒光標記細胞內(nèi)LC3的分布,發(fā)現(xiàn)LC3可被募集到白念珠菌孢子周圍,參與對白念珠菌的吞噬過程。通過分析白念珠菌、LC3、吞噬關鍵分子Rubicon、溶酶體的共定位關系,驗證了 LC3相關吞噬(LAP)的存在;且白念珠菌的處理會導致LC3的募集,而不伴自噬流的關鍵分子p62、ATG9A的共定位,證明了白念珠菌被巨噬細胞吞噬的過程主要發(fā)生LAP,而非形成自噬小體。為探索白念珠菌抑制巨噬細胞基礎自噬流的分子機制,本研究通過白念珠菌聯(lián)合雷帕霉素、Torin 1、pp242等MTOR抑制劑體外誘導THP-1巨噬樣細胞,western blotting檢測MTOR通路磷酸化水平的變化,發(fā)現(xiàn)白念珠菌通過非MTOR依賴途徑減低巨噬細胞的自噬流水平;然而,白念珠菌重要的胞壁成分β-glucan的誘導可增加THP-1巨噬樣細胞的基礎自噬流。我們推斷,吞噬白念珠菌后基礎自噬流減低的效應可能與LAP發(fā)生時對LC3的占用相關。我們還探討了白念珠菌減低自噬流的效應對巨噬細胞DNA合成、增殖、凋亡、活性氧產(chǎn)生的影響,并發(fā)現(xiàn)白念珠菌誘導除抑制自噬流外,還會導致明顯的DNA合成的抑制,但對細胞凋亡、增殖水平無明顯影響。白念珠菌誘導可導致活性氧產(chǎn)生增加;然而,通過藥物增加自噬水平后并不影響白念珠菌對活性氧誘導的水平。自噬在巨噬細胞抗念珠菌免疫反應中的作用仍有待繼續(xù)研究。
【學位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R756
【部分圖文】：

３）?ＰＢＳ?ｌｉｐｏｓｏｍｅ＋ＳＣ５３１４?組：ｄ－１、ｄｌ?靜脈注射?ＰＢＳ?ｌｉｐｏｓｏｍｅ?２０（＾Ｌ／ｍｏｕｓｅ；?ｄＯ?靜??脈注射?ＳＣ５３１４?ｌｘｌ〇６ＣＦＵ／ｍｏｕｓｅ〇??４）?Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ?ｌｉｐｏｓｏｍｅ＋ＳＣ５３１４?組：ｄ－１、ｄｌ?靜脈注射?Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ?ｌｉｐｏｓｏｍｅ??２００（ａＬ／ｍｏｕｓｅ；?ｄＯ?靜脈注射?ＳＣ５３１４?ｌｘｌ〇６ＣＦＵ／ｍｏｕｓｅ。??２．觀察小鼠狀態(tài)，每日固定時間稱重，記錄小鼠存活情況，小鼠存活率＝（小鼠總??數(shù)一死亡小鼠數(shù)）／小鼠總數(shù)ｘｌＯＯ％。??結果??一．小鼠白念珠菌腹腔感染模型中不同免疫細胞的吞噬作用比較??小鼠腹腔注射熒光標記的白念珠菌（熒光標記不影響白念珠菌活力）不同時間??點后，分析腹腔細胞內(nèi)吞噬白念珠菌的各種細胞成分比例的變化。發(fā)現(xiàn)隨著感染時??間的延長，巨噬細胞吞噬白念珠菌的比例逐漸增高，在４小時后持續(xù)為數(shù)量最高的??細胞（圖１），說明了在白念珠菌局部感染后，巨噬細胞是持續(xù)存在的、最主要的免??疫細胞。??＾１〇°＂???Ｍａｃｒｏｈａｅ??

?０．００１）。而中性粒細胞的比例在不同小鼠組間無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義，見??圖３。??＿?＿?＊＊＊??６〇－｜?Ｉ?１??ＩＳ?＿??２?３〇－?■?Ｉ??Ｓ?２０＿圍與ｓ??＾?１０?丄??〇?Ｉ剩?Ｉ＝ｉ?Ｉ?＿＿?＊?＿＿??ｈ?＾?ＥＳ３?＝?麵?隱?ＰＢＳ??ｉ?２：?＿?＿?■丨?＊＊?Ｉ?圓翏?Ｅ３３?ＰＢＳ－ｌｉｐｏｓｏｍｅ??ｑＩ?ｉｌ＾?ｔｓｓａ?ｐｍ?—?ＥｘＳａ?ＥＳ３?國?Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ－ｌｉｐｏｓｏｍｅ??＼ｂｄｏｍｉｎａｌ?ｃａｖｉｔｙ?Ｌｙｍｐｈ?ｎｏｄｅ?Ｓｐｌｅｅｎ??圖２小鼠注射ｌｉｐｏｓｏｍｅ后不同器官的巨噬細胞比例變化（＊＊戶＜０．０１；?＊＊＊Ｐ＜０．００１）??ＮＳ??８－１?Ｉ?１??一?工??｜?６－?兩??�。矗�?議圖＿?＿?Ｑ??＝２＿?＿?ＮＳ?圖?Ｅ：ｓ３?■?園?ＰＢＳ??ｚ?幽肉圉?＇?１?纏陶國?ｍ?ＰＢＳ－ｌｉｐｏｓｏｍｅ??圉應圍＠圍?ｓ?Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ－ｌｉｐｏｓｏｍｅ??Ａｂｄｏｍｉｎａｌ?ｃａｖｉｔｙ?Ｌｙｍｐｈ?ｎｏｄｅ?Ｓｐｌｅｅｎ??圖３小鼠注射ｌｉｐｏｓｏｍｅ后不同器官的中性粒細胞比例變化（ＮＳ：無差異）??三．小鼠系統(tǒng)感染白念珠菌菌株Ｃ１Ｍ、ＳＣ５３１４后體重變化情況??小鼠分組后分別靜脈注射白念珠菌菌株Ｃ１Ｍ、ＳＣ５３１４孢子ｌｘｌ〇６ＣＦＵ／ｍｏｕｓｅ，??檢測每組小鼠的體重變化，體重曲線見圖４�？梢姲啄钪榫辏樱茫担常保吹亩玖Τ�??度明顯強于Ｃ１Ｍ。后續(xù)實驗將使用這兩種毒力不同的白念珠菌菌株來確定小鼠清除??巨噬

三．小鼠系統(tǒng)感染白念珠菌菌株Ｃ１Ｍ、ＳＣ５３１４后體重變化情況??小鼠分組后分別靜脈注射白念珠菌菌株Ｃ１Ｍ、ＳＣ５３１４孢子ｌｘｌ〇６ＣＦＵ／ｍｏｕｓｅ，??檢測每組小鼠的體重變化，體重曲線見圖４。可見白念珠菌菌株ＳＣ５３１４的毒力程??度明顯強于Ｃ１Ｍ。后續(xù)實驗將使用這兩種毒力不同的白念珠菌菌株來確定小鼠清除??巨噬
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本文編號：2873290