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吉西他濱促進HepG2.2.15細胞系中乙肝病毒pgRNA轉(zhuǎn)錄和病毒復(fù)制及相關(guān)分子機制研究

發(fā)布時間:2020-11-09 05:21
   目的:探討吉西他濱對HepG2.2.15細胞中乙肝病毒前基因組RNA(pregenomic RNA,pgRNA)轉(zhuǎn)錄以及乙肝病毒復(fù)制的影響及其可能的作用機制。方法:使用不同濃度吉西他濱處理HepG2.2.15細胞,分別使用CCK-8法、流式細胞術(shù)、實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)、酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)法檢測細胞活性、細胞凋亡、細胞周期、細胞內(nèi)乙肝病毒pgRNA、細胞培養(yǎng)上清液中乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)、乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)、乙肝病毒DNA(hepatitis B virus DNA,HBV DNA);實時定量PCR法檢測吉西他濱作用下HepG2.2.15細胞中與pgRNA轉(zhuǎn)錄有關(guān)的調(diào)控基因肝細胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor4,HNF4α)、P38蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase,P38MAPK)、環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白1(CAMP responsive element binding protein 1,CREB1)、核轉(zhuǎn)錄因子p65(nuclear factor-kappa B p65,NF-κb p65)、組蛋白去乙;1(histone deacetylase 1,HDAC1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha,PGC-1α)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子O1(forkhead box protein O1,FOXO1)、相關(guān)調(diào)控基因沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(sirtuin 1,SIRT1)、P53 mRNA水平以及pgRNA的表達量,分析這些基因隨吉西他濱濃度變化與pgRNA隨濃度變化的相關(guān)性,找出與pgRNA變化相關(guān)性最高的基因,并使用Western blot在蛋白質(zhì)水平驗證吉西他濱對此基因蛋白質(zhì)表達量的影響。結(jié)果:吉西他濱對HepG2.2.15細胞的生長顯示出濃度以及劑量依賴性的抑制作用;吉西他濱使細胞凋亡率增高;吉西他濱使細胞更多的細胞停滯在G_0G_1期,而處于S期細胞比例降低;吉西他濱明顯增加HepG2.2.15細胞內(nèi)乙肝病毒pgRNA,72 h之內(nèi)呈現(xiàn)明顯的時間與劑量依賴性;吉西他濱作用細胞24 h會使細胞培養(yǎng)上清液中的HBeAg增加;吉西他濱促進HNF4αmRNA、HNF4α蛋白質(zhì)表達量增加,且在所檢測的與乙肝病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)的基因中,HNF4αmRNA變化趨勢與HBV pgRNA變化趨勢相關(guān)性最高。結(jié)論:吉西他濱可在細胞水平促進乙肝病毒pgRNA轉(zhuǎn)錄以及乙肝病毒的復(fù)制,其機制為通過促進乙肝病毒轉(zhuǎn)錄因子HNF4α的表達實現(xiàn)的。
【部分圖文】:

吉西他濱,乙肝,病毒


24、48、72 h時吉西他濱明顯增加HepG2.2.15細胞中的乙肝病毒pgRNA(與各自的對照組相比,24 h時2、20、50μmol/L吉西他濱組的P值分別為0.005、0.001、0.006;48 h時P值分別為0.004、0.000、0.024;72 h時P值分別為0.003、0.003、0.001),吉西他濱導(dǎo)致的乙肝病毒pgRNA的增加呈明顯的時間以及劑量依賴性。當藥物作用于HepG2.2.15細胞96 h,乙肝病毒pgRNA增加的幅度不再明顯(P值分別為0.026、0.117、0.092),增加幅度在96 h時無時間依賴性(表5、圖1)。2.6 吉西他濱對乙肝病毒pgRNA相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子m RNA的影響以及各基因m RNA變化與pg RNA變化的相關(guān)性分析

趨勢圖,途徑,趨勢,吉西他濱


不同濃度的吉西他濱作用于HepG2.2.15細胞48 h,檢測乙肝病毒pgRNA以及各pgRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因mRNA的表達量,使用相鄰兩濃度乙肝病毒pgRNA表達量的差值、各相關(guān)調(diào)控基因mRNA表達量的差值進行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示(圖2、圖3、圖4),在所有3個途徑的9個與pgRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的基因中,隨著吉西他濱濃度的變化,HNF4αmRNA的變化趨勢與pgRNA的變化趨勢相關(guān)性最高(r=0.934,P=0.020),其余基因mRNA變化趨勢與pgRNA變化趨勢相關(guān)性不顯著(均P>0.05)。2.7 吉西他濱對HepG2.2.15細胞中HNF4α蛋白表達量的影響

趨勢圖,途徑,趨勢,相關(guān)性


除最大濃度的100μmol/L外,與對照組相比,所有濃度的吉西他濱均會導(dǎo)致HepG2.2.15細胞中HNF4α蛋白的表達量增加(表7、圖5)。圖4 途徑三(去乙;窰DAC1、SIRT1途徑)mRNA變化趨勢與pgRNA變化趨勢的相關(guān)性
【相似文獻】

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本文編號:2875951

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