目的本研究旨在探究sifA基因?qū)δc炎沙門菌胞內(nèi)寄生和增殖的影響,以探索腸炎沙門菌的致病機理。方法根據(jù)同源重組原理,無痕構(gòu)建腸炎沙門菌C50041的sifA基因缺失株,通過藍白斑、抗生素耐藥性、PCR和基因測序方法對基因缺失株進行鑒定,并從生物學特性、胞內(nèi)沙門菌增殖、sifA基因在胞內(nèi)外菌中表達等方面,分析sifA基因?qū)δc炎沙門菌的影響。結(jié)果成功構(gòu)建腸炎沙門菌C50041ΔsifA,藍白斑、抗生素耐藥性、PCR和基因測序方法證明該菌株是正確的。其生長速度和生化特性沒有發(fā)生改變。ΔsifA株感染巨噬細胞后,其胞內(nèi)沙門菌量顯著少于其野生株。sifA基因在spiC基因缺失株中表達量增加。結(jié)論腸炎沙門菌C50041ΔsifA被成功構(gòu)建,其在巨噬細胞內(nèi)的增殖量顯著降低,sifA基因表達可能受spiC基因調(diào)控,本研究為深入探究腸炎沙門菌在細胞內(nèi)增殖及sifA基因的功能奠定基礎(chǔ)。

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【部分圖文】：

圖1重組質(zhì)粒中sifA基因上下游同源片段的PCR驗證

PCR擴增sifA基因上下游同源片段,利用一步連接法試劑盒將sifA基因上下游同源片段連接到SalⅠ酶切的自殺質(zhì)粒pGMB152載體上,形成重組自殺質(zhì)粒pGMB152-ΔsifA,轉(zhuǎn)化E.coli.Spy372感受態(tài)細菌,構(gòu)建重組菌E.coli.Spy37(pGMB152-Δ....

圖2載體特異引物pGMB152-F/RPCR驗證重組菌中pGMB152-ΔsifA

圖1重組質(zhì)粒中sifA基因上下游同源片段的PCR驗證2.1.2構(gòu)建供體重組菌E.coli.χ7213(pGMB152-ΔsifA)

圖3引物sifA-U-F/sifA-D-RPCR重組沙門菌結(jié)果

自殺質(zhì)粒pGMB152的復制需要一種特定的蛋白,而腸炎沙門菌C50041中不含該蛋白,所以pGMB152質(zhì)粒在C50041中無法復制。用不含NaCl含10%蔗糖的LB液體培養(yǎng)基傳代后在含X-gal、IPTG的LB平板上的白色菌落有兩種可能:一是同源片段雙交換,sifA基因缺失的菌....

圖4引物pGMB152-F/RPCR重組沙門菌結(jié)果

圖3引物sifA-U-F/sifA-D-RPCR重組沙門菌結(jié)果圖5C50041ΔsifA藍白斑驗證和抗生素耐藥性分析

本文編號：3999732