miRNAs是一類長約22nt的非編碼小RNA,可與靶基因3'-UTR區(qū)結(jié)合形成二聚體從而抑制靶基因的翻譯或者直接降解靶mRNA,實現(xiàn)調(diào)控靶基因的表達的生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)miRNA調(diào)控基因組30%以上的基因表達,參與細胞的增殖、分化以及凋亡等生物學(xué)過程。線粒體是細胞的能量加工廠,其拷貝數(shù)的多少決定了細胞能量代謝的水平,不同類型的細胞因其能量需求的差異使得線粒體含量有所不同。肌纖維的異質(zhì)性與不同肌纖維類型之間的能量代謝差異密切相關(guān),在慢肌中線粒體含量較高,主要進行有氧呼吸；而在快肌纖維中因其線粒體含量較低,主要進行無氧呼吸。在肉質(zhì)研究中,慢肌纖維因其較高的線粒體含量和低的糖元濃度,而具有較低的糖酵解潛力,從而使慢肌纖維含量高的肌肉具有更好的肉質(zhì)。本研究利用C2C12細胞,探究miR-23a和miR-27b對細胞線粒體拷貝數(shù)的影響,繼而研究線粒體拷貝數(shù)變化引起的細胞能量代謝差異對成肌細胞分化和肌纖維類型組成的影響,結(jié)果如下：1.在Lipofectamine 2000和mimic(或inhibitor)濃度分別為1 .56μl/cm2和150nM時,C2C12細胞的轉(zhuǎn)染效率達到最高,為43%...

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
1 文獻綜述
    1.1 miRNA的研究進展
        1.1.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)
        1.1.2 miRNA的形成與作用機制
        1.1.3 現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)在miRNA研究中的應(yīng)用
        1.1.4 miRNA靶基因預(yù)測與驗證方法的研究
        1.1.5 miR-23a和miR-27b的研究現(xiàn)狀
    1.2 肌纖維類型與肉質(zhì)的研究進展
        1.2.1 肌纖維的結(jié)構(gòu)
        1.2.2 肌纖維類型的分類方法
        1.2.3 肌纖維類型的特征
        1.2.4 肌纖維類型對肉質(zhì)的影響
    1.3 線粒體拷貝數(shù)的研究
        1.3.1 線粒體的生物學(xué)功能
        1.3.2 線粒體的生物合成
        1.3.3 線粒體生成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
    1.4 本實驗的研究內(nèi)容和意義
2 材料與方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 實驗試劑
        2.1.2 主要儀器設(shè)備
        2.1.3 肌肉miRNA高通量測序數(shù)據(jù)
        2.1.4 組織、細胞總DNA
        2.1.5 組織、細胞總RNA
        2.1.6 引物合成
        2.1.7 質(zhì)粒、菌株和細胞系
    2.2 試驗方法
        2.2.1 生物信息學(xué)分析
        2.2.2 組織和細胞總DNA提取
        2.2.3 組織和細胞總RNA提取
        2.2.4 mRNA反轉(zhuǎn)錄
        2.2.5 miRNA反轉(zhuǎn)錄
        2.2.6 PCR的擴增與條帶檢測
        2.2.7 Real-time PCR
        2.2.8 Foxj3和Mef2c基因部分3'-UTR的擴增及克隆測序
        2.2.9 Foxj3和Mef2c基因部分3'-UTR的真核表達載體的構(gòu)建
        2.2.10 C2C12細胞的培養(yǎng)
        2.2.11 Hela細胞的培養(yǎng)
        2.2.12 熒光素酶活性檢測
        2.2.13 細胞線粒體染色
3 結(jié)果與分析
    3.1 調(diào)控線粒體拷貝數(shù)MIRNA的篩選
    3.2 miR-23a和miR-27b與靶基因結(jié)合位點的進化保守性分析
        3.2.1 miR-23a和miR-27b與靶基因結(jié)合位點和二級結(jié)構(gòu)分析
        3.2.2 Mef2c與Foxj3基因的保守性和miR-23a與miR-27b的種子序列的保守性
    3.3 Mef2c和Foxj3的3'-UTR片段雙熒光素酶報告基因載體構(gòu)建
        3.3.1 Mef2c和Foxj3基因3'-UTR區(qū)擴增
        3.3.2 重組質(zhì)粒Mef2c 3'-UTR psiCHECK^TM-2和Foxj3 3'-UTR psiCHECK^TM-2構(gòu)建與鑒定
        3.3.3 重組質(zhì)粒Mef2c 3'-UTR psiCHECK^TM-2和Foxj3 3'-UTR psiCHECK^TM-2的序列分析
    3.4 miR-23a與Mef2c和miR-27b與Foxj3間靶基因關(guān)系的驗證
    3.5 miR-23a與miR-27b對C2C12細胞肌纖維類型的影響
        3.5.1 C₂C₁₂轉(zhuǎn)染效率的優(yōu)化
        3.5.2 C₂C₁₂增值和分化過程中miR-23a和miR-27b以及線粒體拷貝數(shù)的變化
        3.5.3 過表達或抑制miR-23a和miR-27b對線粒體拷貝數(shù)的影響
        3.5.6 miR-23a和miR-27b與線粒體和肌纖維類型的相關(guān)性在豬多個肌肉組織中的驗證
4 討論
    4.1 miR-23a與miR-27b的篩選
    4.2 C₂C₁₂細胞轉(zhuǎn)染效率的優(yōu)化
    4.3 miR-23a與miR-27b對線粒體拷貝數(shù)和肌纖維類型的影響
5 結(jié)論
參考文獻
致謝
攻讀碩士學(xué)位之間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：4043894