喹賽多是新型喹噁啉類廣譜抗菌促生長的動物專用藥,其化學結構保留了喹噁啉-1,4-二氧化物母環(huán),同時在其基礎上對側鏈進行改造,以降低毒性的同時保留其抗菌活性。本實驗室現(xiàn)已從基礎毒理、抗菌活性、基礎代謝和抗菌促生長機理等各方面對喹賽多進行深入研究,以求證實其安全無毒,抗菌促生長的同時闡明其發(fā)揮作用的分子機制。2007年,朱慧玲研究了喹賽多對豬體內內分泌的影響,發(fā)現(xiàn)喹賽多可以在整體水平調節(jié)體內多種重要內分泌因子的表達,其中最值得關注的為生長激素(GH)的上調表達,然而其作用機制尚不清楚。為了闡明喹賽多影響GH合成和分泌的分子機制,本課題以大鼠垂體腺瘤細胞(GH3細胞)暴露于喹賽多為實驗材料,運用Afrymetrix公司的GeneChip? Rat Gene1.0ST Array芯片和雙向電泳—質譜聯(lián)用技術,查找喹賽多作用于GH3細胞后差異表達的基因和蛋白,以求更加全面的了解喹賽多作用后GH3細胞內發(fā)生的變化。進而通過Gene Ontology, KEGG等進行功能富集分析,找到發(fā)揮作用的功能基因組和蛋白質組,綜合分析基因組和蛋白組的結果,進而闡明喹賽多影響GH合成和分泌的分子機理。 1.基...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
1 前言
    1.1 喹賽多的研究進展
    1.2 GH轉錄,合成和分泌的研究進展
    1.3 本課題研究技術
    1.4 研究內容和目標
2 材料方法
    2.1 細胞株
    2.2 主要試劑
    2.3 主要儀器
    2.4 主要試劑的配制
    2.5 細胞培養(yǎng)及凍存
    2.6 細胞總RNA的提取
        2.6.1 細胞處理
        2.6.2 RNA的提取
        2.6.3 RNA濃度測定及質量檢測
    2.7 cDNA的合成
    2.8 實時熒光定量PCR方法檢測GHmRNA表達水平的變化
        2.8.1 引物設計
        2.8.2 實時熒光定量PCR反應體系
        2.8.3 實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析
        2.8.4 統(tǒng)計學分析
    2.9 ELISA方法檢測GH分泌量的變化
        2.9.1 待測樣品準備
        2.9.2 GH分泌量測定步驟
        2.9.3 結果計算
    2.10 BCA法檢測細胞內總蛋白含量
    2.11 Western Blot方法檢測GH蛋白表達情況
        2.11.1 細胞處理
        2.11.2 細胞蛋白提取及濃度測定
        2.11.3 SDS-PAGE凝膠電泳
        2.11.4 轉膜
        2.11.5 封閉
        2.11.6 一抗孵育
        2.11.7 二抗孵育
        2.11.8 化學發(fā)光顯色
    2.12 喹賽多對GH3細胞影響的基因表達譜檢測
        2.12.1 總RNA的提取和純化
        2.12.2 cDNA的合成和純化
        2.12.3 IVT合成cRNA和cRNA的純化
        2.12.4 cRNA片段化
        2.12.5 芯片雜交
        2.12.6 芯片洗脫
        2.12.7 芯片掃描
    2.13 實時熒光定量PCR驗證基因芯片中差異基因的mRNA表達
        2.13.1 引物設計
        2.13.2 實時熒光定量PCR反應體系
        2.13.3 實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析
        2.13.4 統(tǒng)計學分析
    2.14 雙向電泳技術檢測GH3細胞差異蛋白質組學研究
        2.14.1 細胞處理及分組
        2.14.2 細胞總蛋白的制備
        2.14.3 蛋白質定量
        2.14.4 蛋白質水化上樣
        2.14.5 一相等點聚焦(IEF)
        2.14.6 IPG膠條平衡
        2.14.7 二相SDS-PAGE電泳
        2.14.8 染色
        2.14.9 圖像掃描及分析
    2.15 蛋白質質譜鑒定
        2.15.1 膠內酶解
        2.15.2 MALDI-TOF質譜分析及數(shù)據(jù)庫搜索
    2.16 Western Blot方法驗證差異蛋白的表達情況
        2.16.1 細胞處理
        2.16.2 細胞蛋白提取及濃度測定
        2.16.3 SDS-PAGE凝膠電泳
        2.16.4 轉膜
        2.16.5 封閉
        2.16.6 一抗孵育
        2.16.7 二抗孵育
        2.16.8 化學發(fā)光顯色
3 結果
    3.1 GH3細胞培養(yǎng)
    3.2 RNA濃度的測定及質量檢測
        3.2.1 RNA濃度測定
        3.2.2 RNA質量的檢測
    3.3 喹賽多作用于GH3細胞GHmRNA表達水平的變化
        3.3.1 溶解曲線和標準曲線
        3.3.2 喹賽多作用于GH3細胞GHmRNA表達水平的變化
        3.3.3 PCR產物的驗證
    3.4 ELISA方法檢測喹賽多作用下GH3細胞中GH分泌量的變化
        3.4.1 ELISA方法檢測GH分泌量的標準曲線
        3.4.2 喹賽多作用于GH3細胞GH分泌量的變化
    3.5 喹賽多作用于GH3細胞總蛋白的變化
    3.6 Western blot檢測GH蛋白的表達水平
    3.7 基因芯片顯示的差異基因分析
    3.8 Real-time PCR驗證基因芯片中部分差異基因的mRNA表達
        3.8.1 相關基因定量溶解曲線和標準曲線
        3.8.2 熒光定量PCR驗證基因與芯片結果對比情況
    3.9 雙向電泳尋找喹賽多作用GH3細胞后差異表達蛋白結果
        3.9.1 蛋白質定量
        3.9.2 喹賽多對GH3細胞差異蛋白質組學分析
        3.9.3 差異蛋白點質譜鑒定結果
        3.9.4 Western blot驗證基因芯片和雙向電泳結果
4 討論
    4.1 喹賽多對GH3細胞作用差異基因的分析
        4.1.1 喹賽多孵育GH3細胞1h差異表達的基因
        4.1.2 喹賽多孵育GH3細胞12h差異表達的基因
    4.2 差異基因的功能分析
        4.2.1 細胞內信號轉導相關基因
        4.2.2 調節(jié)物質能量代謝相關基因
        4.2.3 離子轉運相關基因
    4.3 喹賽多對GH3細胞作用差異蛋白的分析
    4.4 喹賽多對GH3細胞作用差異蛋白功能分析
        4.4.1 分子伴侶
        4.4.2 細胞轉運蛋白
        4.4.3 蛋白激酶因子
        4.4.4 維持細胞形態(tài)相關蛋白
        4.4.5 物質代謝與能量代謝
    4.5 基因芯片及雙向電泳結果之間的關系
    4.6 喹賽多影響GH3細胞GH合成和分泌的分子機理
5 全文總結
6 文獻綜述：藥物基因組和蛋白質組研究進展
    1 藥物基因組學研究進展
        1.1 藥物基因組學發(fā)展簡史
        1.2 藥物基因組概念與基本原理
        1.3 藥物基因組的主要研究方法
            1.3.1 表型和基因型分析
            1.3.2 藥物效應圖譜
            1.3.3 連鎖分析及關聯(lián)分析
            1.3.4 單核苷酸多態(tài)性
            1.3.5 基因芯片技術
            1.3.6 基因表達連續(xù)分析
        1.4 藥物基因組的研究現(xiàn)狀
            1.4.1 尋找新藥靶
            1.4.2 加速新藥研發(fā)
            1.4.3 指導臨床合理用藥
        1.5 藥物基因組的發(fā)展前景
    2 藥物蛋白質組的研究進展
        2.1 藥物蛋白質組的發(fā)展簡史
        2.2 藥物蛋白質組的概念與基本原理
        2.3 藥物蛋白質組的主要研究方法
            2.3.1 雙向電泳與質譜聯(lián)用
            2.3.2 液相色譜(LC)分離配合質譜(MS)鑒定
            2.3.3 生物質譜技術
            2.3.4 生物傳感芯片質譜技術
            2.3.5 同位素標記親和標簽技術(ICAT)
            2.3.6 蛋白質芯片
            2.3.7 酵母雙雜交系統(tǒng)和其他技術
        2.4 藥物蛋白質組的研究現(xiàn)狀
            2.4.1 藥物靶點的發(fā)現(xiàn)
            2.4.2 闡明藥物作用機制
            2.4.3 藥物的篩選和新藥發(fā)現(xiàn)
        2.5 藥物蛋白質組的發(fā)展前景
參考文獻
致謝
作者簡介
附錄



本文編號：4054300