本試驗旨在研究布魯氏菌病疫苗的新型研制方法,并通過op誘導(dǎo)劑成功誘導(dǎo)出一株粗糙型牛種布魯氏菌弱毒株,命名為RB71。試驗檢測了RB71相關(guān)基因的缺失情況,并對其脂多糖完整性、生長特性、遺傳穩(wěn)定性以及在小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)中生存能力等與光滑型菌株進行了比較研究。結(jié)果顯示,試驗成功獲得了誘導(dǎo)突變株,其缺失片段大小為15 070 bp;熱凝集試驗陽性,能被結(jié)晶紫染色,吖啶黃凝集試驗陽性;對提取脂多糖進行銀染,結(jié)果顯示O鏈缺失,誘導(dǎo)株RB71脂多糖不完整;連續(xù)傳代30次,PCR檢測未發(fā)現(xiàn)基因回復(fù)突變;在體外相同培養(yǎng)條件下,誘導(dǎo)株RB71生長速度顯著低于親本株A19;入侵RAW264.7細(xì)胞72 h時,其胞內(nèi)存活率與親本株相比極顯著下降(P<0.01)。綜上所述,本試驗開發(fā)出一種能高效誘導(dǎo)光滑型布魯氏菌變異為粗糙型布魯氏菌的試劑及誘導(dǎo)方法,成功獲得一株具有良好遺傳穩(wěn)定性的粗糙型減毒布魯氏菌RB71誘導(dǎo)株,該誘導(dǎo)株在RAW264.7細(xì)胞內(nèi)的存活能力顯著變?nèi)?這為新型弱毒布魯氏菌粗糙型疫苗的研制奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

圖1 誘導(dǎo)菌株初篩及表型鑒定

對誘導(dǎo)初代菌落進行結(jié)晶紫染色鑒定(圖1)。用放大鏡觀察菌落邊緣著色情況發(fā)現(xiàn),1號菌落邊緣不著色,整齊,圓潤;2號菌落邊緣著色,界限不清晰。挑取1和2號單菌落擴大培養(yǎng),并對其表型進行鑒定。熱凝集試驗結(jié)果顯示,1號菌株菌液不產(chǎn)生沉淀依舊混濁,2號菌株菌液出現(xiàn)絮狀沉淀而液體清亮(圖1A....

圖2 PCR檢測布魯氏菌脂多糖合成相關(guān)基因

根據(jù)表1引物序列,進行PCR擴增,檢測布魯氏菌脂多糖合成相關(guān)基因缺失情況,結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出第13和14泳道,親本株A19有目的條帶,而誘導(dǎo)缺失株RB71未出現(xiàn)條帶,推測布魯氏菌RB71菌株中wboA和wboB基因缺失。2.2.2誘導(dǎo)株部分缺失基因范圍的檢測

圖7 誘導(dǎo)株RB71與親本株A19的生長曲線

匯總所測D600nm值,繪制誘導(dǎo)株RB71和親本株A19生長曲線(圖7)。由圖7可知,RB71進入生長對數(shù)期的時間及穩(wěn)定期的時間晚于親本株,A19株可在培養(yǎng)44h后到達穩(wěn)定期,而RB71則需要培養(yǎng)52h才進入穩(wěn)定期,并且RB71穩(wěn)定期的細(xì)菌濃度顯著低于A19,說明RB71基....

圖4 誘導(dǎo)株RB71缺失鑒定

圖3誘導(dǎo)株RB71部分基因缺失范圍的測定2.3細(xì)菌脂多糖完整性鑒定

本文編號：4055464