[本課題前期研究工作基礎(chǔ)] 腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,生存率低,研究表明,miRNA表達(dá)異常、DNA甲基化狀態(tài)改變、組蛋白修飾等表觀遺傳機(jī)制的異常在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。本實驗室前期采用最新高通量甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)結(jié)合啟動子區(qū)及CpG島芯片技術(shù),篩選并初步建立腦膠質(zhì)瘤基因組DNA甲基化譜。通過Massarray、亞硫酸氫鹽修飾直接測序法(BSP)等進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)并驗證了LRRC4等9個腦膠質(zhì)瘤中新的高甲基化基因。通過HPLC-DAD技術(shù)對全基因組甲基化分析發(fā)現(xiàn),抑瘤性miR-185可通過直接靶向DNMT1的表達(dá)而影響全基因組的甲基化水平,進(jìn)而調(diào)控上述高甲基化基因在腦膠質(zhì)瘤中的甲基化修飾狀態(tài),恢復(fù)這些基因在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)。 [確定F10、POTEH, CPEB1、LMO3、ELFN2及PRDM16為腦膠質(zhì)瘤中新的低甲基化基因,其甲基化狀態(tài)和表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)] 在上述研究工作基礎(chǔ)上,本課題利用Signalmap軟件對甲基化芯片篩選出的74個低甲基化基因進(jìn)行再次篩選,挑選出F10、POTEH、 CPEB1、LMO...

【文章頁數(shù)】：155 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要縮略詞簡表
第一章 前言
第二章 材料與方法
    1 材料
        1.1 細(xì)胞系和組織樣本
        1.2 菌株和質(zhì)粒載體
        1.3 試劑
        1.4 主要儀器
    2 方法
        2.1 細(xì)胞基因組DNA提取(根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作)
        2.2 細(xì)胞RNA制備
        2.3 細(xì)胞蛋白抽提及定量
        2.4 Western blot檢測
        2.5 質(zhì)粒、miRNA或siRNA轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞
        2.6 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測
        2.7 免疫組織化學(xué)法
        2.8 原位雜交
        2.9 免疫組織化學(xué)法和原位雜交結(jié)果分析
        2.10 細(xì)胞計數(shù)實驗
        2.11 細(xì)胞劃痕實驗
        2.12 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測(根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作)
        2.13 組蛋白去甲基化酶活性檢測(根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作)
        2.14 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性或DNMT3A活性檢測
        2.15 亞硫酸氫鹽修飾樣品gDNA制備(根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作)
        2.16 直接測序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)
        2.17 甲基化特異性PCR(Methylated specific PCR,MSP)
        2.18 載體構(gòu)建
        2.19 熒光報告素酶活性分析
        2.20 ChIP檢測(按照試劑盒說明書操作)
        2.21 統(tǒng)計學(xué)分析
第三章 結(jié)果
    第一部分 全基因組DNA甲基化譜中低甲基化基因的驗證及其與臨床相關(guān)性研究
        1.1 全基因組DNA甲基化譜中低甲基化基因的重新篩選與驗證
        1.2 低甲基化基因F10、POTEH、CPEB1、LMO3、ELFN2及PRDM16在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其與基因低甲基化的關(guān)系
        1.3 低甲基化基因的甲基化狀態(tài)與患者臨床參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系
        1.4 低甲基化基因的表達(dá)與患者臨床參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系
        小結(jié)
    第二部分 miR-101調(diào)控腦膠質(zhì)瘤中低甲基化基因的甲基化水平和其表達(dá)的作用機(jī)制
        2.1 腦膠質(zhì)瘤中調(diào)控低甲基化基因的miRNA的預(yù)測
        2.2 miR-101在腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)及其與腦膠質(zhì)瘤患者臨床參數(shù)和預(yù)后預(yù)測的關(guān)系分析
        2.3 miR-101抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力
        2.4 低甲基化基因CPEB1、LMO3、ELFN2及PRDM16作為miR-101靶基因的驗證
        2.5 miR-101通過直接靶向抑制組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶EZH2、EED和DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3A影響LMO3基因核心啟動子區(qū)的組蛋白甲基化修飾,調(diào)控LM03的甲基化水平,抑制其表達(dá)
        2.6 miR-101通過靶向抑制EZH2、EED及DNMT3A影響CPEB1、ELFN及PRDM16基因啟動子區(qū)的組蛋白甲基化修飾而調(diào)控它們的甲基化狀態(tài),間接抑制其表達(dá)
        小結(jié)
    第三部分 miR-101通過組蛋白甲基化修飾調(diào)控腦膠質(zhì)瘤中高甲基化基因LRRC的作用機(jī)制
        3.1 miR-101間接調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的高甲基化基因LRRC4的表達(dá)
        3.2 miR-101通過靶向EZH2、EED及DNMT3A影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中LRRC4基因核心啟動子區(qū)的組蛋白甲基化修飾,減低LRRC4基因的高甲基化水平,間接恢復(fù)其在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)
        3.3 高甲基化基因LRRC4表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后預(yù)測的關(guān)系
第四章 討論
    第一部分 全基因組甲基化芯片中低甲基化基因的驗證及其與臨床相關(guān)性研究
        1.1 發(fā)現(xiàn)并證實了腦膠質(zhì)瘤中6個新的低甲基化基因
        1.2 F10、POTEH、CPEB1、ELFN2、LMO3及PRDM16在腦膠質(zhì)瘤中的低甲基化或高表達(dá)可以作為腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后預(yù)測的重要標(biāo)志
    第二部分 miR-101調(diào)控腦膠質(zhì)瘤中低甲基化基因甲基化水平及表達(dá)的作用機(jī)制
        2.1 miR-101在腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)及其與腦膠質(zhì)瘤患者臨床參數(shù)和預(yù)后預(yù)測的關(guān)系分析
        2.2 miR-101直接靶向抑制低甲基化基因CPEB1、ELFN2、PRDM16的表達(dá)
        2.3 miR-101通過靶向抑制組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2、EED及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A的表達(dá),調(diào)控低甲基化基因核心啟動子區(qū)組蛋白甲基化修飾,影響它們的甲基化狀態(tài),間接抑制它們在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)
    第三部分 miR-101調(diào)控腦膠質(zhì)瘤中高甲基化基因LRRC4的作用機(jī)制
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀博士學(xué)位期間主要研究成果



本文編號：4053093