第一部分引言目前,腫瘤是世界第二大致死性疾病,其發(fā)病率和死亡率在持續(xù)增加,世界衛(wèi)生組織最新數(shù)據(jù)顯示,到2020年,預計全球癌癥發(fā)病率將增加50%。癌癥的發(fā)病機制十分復雜且尚不清楚,與基因、環(huán)境等多種因素有關。最新研究表明,能量代謝紊亂在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮至關重要的作用,糾正腫瘤能量代謝成為腫瘤治療的新策略。單磷酸腺苷活化蛋白激酶(5’-monophosphate adenosine activated protein kinase,AMPK)為細胞的能量感受器,近十年發(fā)現(xiàn)可以明顯抑制腫瘤。在腫瘤細胞中,即使在有氧條件下,糖酵解途徑也是其能量的主要來源,這一現(xiàn)象被稱為Warburg效應。最新研究表明,LKB1/AMPK可以調(diào)節(jié)腫瘤的Warburg效應,但其具體機制尚不明確。線粒體是細胞的能量加工廠,所以AMPK與線粒體之間的關系密不可分。文獻表明,增強線粒體的有氧氧化作用,或抑制糖酵解過程,對腫瘤細胞有明顯的抑制作用,也有文獻報道,AMPK可以抑制Warburg效應。因此我們推測:AMPK可以影響線粒體功能和數(shù)目。為了進一步明確其具體作用機制,我們構(gòu)建了LKB1高表達細胞株A549-L...

【文章頁數(shù)】：110 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
中英文縮略詞表
第1部分 前言
    1.1 腫瘤發(fā)病率和死亡率
    1.2 腫瘤細胞代謝特點
    1.3 AMPK的結(jié)構(gòu)和功能
    1.4 AMPK對線粒體數(shù)目的調(diào)節(jié)作用
    1.5 AMPK對線粒體功能的調(diào)節(jié)作用
    1.6 蛋白質(zhì)的降解
    1.7 命題依據(jù)與假設
第2部分 AMPKα、β亞單位在腫瘤細胞線粒體中定位及其對細胞生物學行為的影響
    2.1 材料
        2.1.1 實驗細胞
        2.1.2 實驗材料
        2.1.3 實驗儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
        2.2.2 搖菌與質(zhì)粒的提取
        2.2.3 細胞培養(yǎng)
        2.2.4 puromycin篩選濃度的確定
        2.2.5 慢病毒mito-AMPK和mito-RFP的包裝
        2.2.6 慢病毒濃縮
        2.2.7 慢病毒感染A549細胞
        2.2.8 Crispr/Cas9轉(zhuǎn)染
        2.2.9 蛋白樣本獲取
        2.2.10 蛋白濃度檢測
        2.2.11 Western blot蛋白體系配制
        2.2.12 Western blot檢測
        2.2.13 細胞增殖檢測
        2.2.14 劃痕實驗
        2.2.15 平板克隆實驗
        2.2.16 統(tǒng)計學分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 AMPKβ在細胞內(nèi)的分布及對腫瘤的抑制作用
        2.3.2 線粒體上AMPKα對腫瘤的抑制作用
    2.4 討論
第3部分 AMPKα和β對線粒體的影響
    3.1 材料
        3.1.1 實驗細胞
        3.1.2 實驗材料
        3.1.3 實驗儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 細胞培養(yǎng)
        3.2.2 Western blot 實驗
        3.2.3 線粒體蛋白在總蛋白的比例
        3.2.4 腺病毒感染細胞
        3.2.5 總RNA提取
        3.2.6 逆轉(zhuǎn)錄實驗
        3.2.7 總DNA提取
        3.2.8 熒光定量PCR實驗
        3.2.9 線粒體活細胞染色
        3.2.10 統(tǒng)計學分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 AMPKα和AMPKβ對線粒體數(shù)目的影響
        3.3.2 AMPKα和AMPKβ對線粒體生物合成的影響
        3.3.3 AMPKα和AMPKβ對線粒體分裂融合的影響
    3.4 討論
第4部分 AMPKα和β對細胞能量代謝的影響
    4.1 材料
        4.1.1 實驗細胞
        4.1.2 實驗材料
        4.1.3 實驗儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 細胞培養(yǎng)
        4.2.2 乳酸檢測
        4.2.3 糖酵解壓力檢測
        4.2.4 XF24培養(yǎng)板細胞接種方法
        4.2.5 統(tǒng)計學分析
    4.3 結(jié)果
    4.4 討論
第5部分 AMPKβ對AMPKα穩(wěn)定性的影響
    5.1 材料
        5.1.1 實驗細胞
        5.1.2 實驗材料
        5.1.3 實驗儀器
        5.1.4 實驗方法
        5.1.5 統(tǒng)計學分析
    5.2 實驗結(jié)果
    5.3 討論
第6部分 AMPKα對腫瘤細胞體內(nèi)成瘤能力的影響
    6.1 材料
        6.1.1 細胞
        6.1.2 材料
        6.1.3 實驗儀器
        6.1.4 實驗方法
    6.2 實驗結(jié)果
    6.3 討論
第7部分 結(jié)論與展望
    7.1 結(jié)論
    7.2 展望
致謝
參考文獻
攻讀學位期間的研究成果
綜述
    參考文獻



本文編號：4046202