【目的】分析轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊外源基因插入位點(diǎn),從而進(jìn)一步完善抗蟲轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的背景信息,推進(jìn)抗蟲轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的安全評(píng)價(jià)及應(yīng)用�！痉椒ā恳赞D(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊株系n12、n222為試驗(yàn)材料,使用高效熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR法(hiTAIL-PCR)分離外源基因插入位點(diǎn)側(cè)翼序列,比對(duì)毛果楊基因組序列確定插入位點(diǎn)。根據(jù)插入位點(diǎn)處的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)2對(duì)特異性PCR檢測(cè)引物,建立轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊外源基因特異性PCR檢測(cè)方法,并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析插入位點(diǎn)周邊基因表達(dá)情況。【結(jié)果】PCR及半定量PCR結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因歐洲黑楊株系的BtCry1Ac基因穩(wěn)定表達(dá)。通過(guò)比對(duì)毛果楊基因組序列確定轉(zhuǎn)基因楊n12 T-DNA插入基因組Chr15的10162773位點(diǎn)即Potri.015G076600第2個(gè)內(nèi)含子,其堿基組成AT含量為65%; n222整合位點(diǎn)為基因組Chr01基因間隔區(qū)41596184位點(diǎn),其堿基組成AT含量為69%。特異性PCR檢測(cè)顯示,n12能擴(kuò)增出709 bp(轉(zhuǎn)基因)和1 159 bp(非轉(zhuǎn)基因)特異性條帶,n222及其與丹紅楊雜交子代能擴(kuò)增出1 265 bp(轉(zhuǎn)...

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【部分圖文】：

圖1PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株及轉(zhuǎn)基因表達(dá)量

將轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊株系n12右邊界hiTAIL-PCR的第2輪和第3輪擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，以AC1、RB-1A為引物的第2輪和AC1、RB-2A為引物的第3輪擴(kuò)增結(jié)果如圖2A所示。隨機(jī)引物L(fēng)AD3第3輪產(chǎn)物應(yīng)比第2輪小80bp(圖2A)。將隨機(jī)引....

圖2轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊n12右邊界序列

圖1PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株及轉(zhuǎn)基因表達(dá)量2.3轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊n222及其雜交子代的T-DNA插入位點(diǎn)

圖3轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊n222左邊界序列

轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊株系n222的4條隨機(jī)引物第2輪和第3輪產(chǎn)物電泳，發(fā)現(xiàn)簡(jiǎn)并引物L(fēng)AD4的第2、3輪產(chǎn)物相差89bp(圖3A)，將條帶回收連接T載體，并測(cè)序獲得215bpDNA片段，1-122bp為載體序列，123-215bp與毛果楊數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)與1號(hào)染色體4....

圖4轉(zhuǎn)BtCry1Ac歐洲黑楊n12(上)、n222(下)插入位點(diǎn)序列特異性檢測(cè)引物位置

株系n12插入Potri.015G076600第2個(gè)內(nèi)含子，編碼絲氨酸蛋白激酶(serine-proteinkinase,SPK);下游2.7kb處為Potri.015G076700共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變家族蛋白(ataxiatelangiectasiamutated....

本文編號(hào)：4002913