研究背景:液體活檢是一種非常有前景的非侵入性的檢測手段,廣泛應用于腫瘤的早期診斷、療效評估、復發(fā)監(jiān)控等;其檢測對象為從原發(fā)腫瘤和/或轉移性沉積物釋放到外周血中的循環(huán)腫瘤細胞和無細胞循環(huán)核酸。循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ct DNA)是腫瘤早期診斷、治療及預后檢測等方面最有前途的生物標志物之一,其攜帶腫瘤的基因突變和甲基化信息等,這些信息有助于腫瘤的診斷、定位、耐藥情況分析等。ct DNA的檢測技術主要分為PCR技術和測序技術兩大類。微滴式數(shù)字PCR(Droplet Digital PCR,dd PCR)檢測靈敏度高,但高成本、低通量制約了其廣泛的臨床應用。傳統(tǒng)PCR和熒光定量PCR是目前臨床應用最廣的基因突變檢測平臺,但是PCR方法對于ct DNA或者稀有突變的檢測具有很大的局限性。雖然,在PCR基礎上改良的稀有突變檢測技術,如AMRS-PCR(Amplification Refractory Mutation System-PCR)、COLD-PCR(Coamplification at Lower Denaturation Temperature PC...

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1 基因型轉換突變富集技術原理圖

采用基因定點突變的方法構建BRAFV600E的野生型和突變型質粒,測序結果可見(圖2),野生型的堿基序列T,突變型的堿基序列為A,其余的堿基序列均一致,證明質粒模板構建成功,可用于后續(xù)的方法建立。圖2BRAFV600E野生型和突變型質粒模板測序鑒定

圖2 BRAF V600E野生型和突變型質粒模板測序鑒定

圖1基因型轉換突變富集技術原理圖4.3限制性內切酶TscAI對BRAFV600E突變的識別能力分析

圖3 限制性內切酶Tsc AI對BRAF V600E野生型模板和突變型模板的酶切效果

BRAF基因V600E突變的位置序列為:TACAGTGAA,正好與限制性內切酶TscAI的識別位點(NNCASTGNN,S=C/G)相同,因此BRAF基因的野生型模板可被TscAI識別和酶切。當BRAF基因為突變型時,序列變成TACAGAGAA,由于識別序列的改變,TscA....

圖4 Hot Star Taq Plus DNA聚合酶在不同的Buffer下擴增情況

本研究建立的方法設計兩種不同酶(一種DNA聚合酶和一種限制性內切酶)在同一個體系中進行反應,如何確保兩種酶均能高效的工作是該技術建立的關鍵。反應Buffer對酶的活性十分重要,許多酶只有在特定的反應Buffer中才有強活性,在別的反應Buffer中活性下降明顯甚至失活。本方法選用....

本文編號：4051487