目的建立一個穩(wěn)定、高效檢測眼內(nèi)液中銅綠假單胞菌的體系。方法采用環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術(shù),由0.1～0.2 mL眼內(nèi)平衡鹽溶液(BSS)模擬眼內(nèi)房水或玻璃體,利用銅綠假單胞菌gbca基因,特異性設計5組LAMP引物,并對擴增方法進行關(guān)鍵試劑的優(yōu)化,檢測眼內(nèi)液中銅綠假單胞菌。結(jié)果該擴增方法經(jīng)過優(yōu)化后,最低可以檢出100 fg/μL純基因組DNA,接近熒光定量靈敏度,具有很好的重現(xiàn)性。此外該方法在檢測眼內(nèi)液中混合的菌落時呈現(xiàn)出良好的檢測效果,可以檢測出2.1×10～2 CFU/mL,極具應用價值。結(jié)論建立了一個穩(wěn)定、高效、靈敏的恒溫擴增體系,可以應用于眼內(nèi)液中銅綠假單胞菌的檢測。

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【部分圖文】：

圖1 銅綠假單胞菌的擴增引物篩選。

如圖1所示,從5組引物中最終篩選出第3組引物,其陰性擴增不出峰,陽性反應出峰時間在30min之前。將其和常見5種眼內(nèi)炎微生物進行交叉擴增,沒有出峰,最終確定該組引物可用于后續(xù)的靈敏度檢測和眼內(nèi)液中銅綠假單胞菌檢測。2.2實時LAMP體系

圖2 銅綠假單胞菌LAMP體系優(yōu)化

鎂離子的濃度和Bst酶的活性有著很高的相關(guān)性,最適合的鎂離子濃度是高效反應的關(guān)鍵。在具體的優(yōu)化實驗中,首先按照標準體系對額外的鎂離子濃度為基準進行優(yōu)化,分別在對應核酸的陰性擴增反應和陽性擴增反應中加入0.1mol/L硫酸鎂0、1、2、3μL,比較其差別,結(jié)果見圖2。由圖見額外....

圖3 銅綠假單胞菌的LAMP檢測靈敏度

將銅綠假單胞菌的基因組DNA以優(yōu)化擴增條件時的核酸濃度向下稀釋108倍,結(jié)果見圖3。從圖中可以看出,優(yōu)化后的LAMP體系(10×ThermoPolReactionBuffer2.5μL,10mmol/LdNTPs3.5μL,引物Mix1μL,0.1mol/....

圖4 實時qPCR靈敏度

對銅綠假單胞菌核酸稀釋實驗,可以發(fā)現(xiàn)LAMP方法在銅綠假單胞檢測體系的檢測限大約是100fg/μL。為了驗證該擴增方法的準確性,我們選擇通用的實時qPCR法對上述9個濃度梯度的核酸進行檢測,結(jié)果如圖4,實時qPCR法可以檢測1fg/μL。2.5灌注液中銅綠假單胞菌的靈敏度檢....

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