副溶血弧菌是一種重要的食源性病原菌,是一種革蘭氏陰性菌,感染后主要定殖在宿主的腸道。食用生的或者未煮熟攜帶副溶血弧菌的海鮮產(chǎn)品可導(dǎo)致急性腸胃炎,常見的感染副溶血弧菌的臨床表現(xiàn)有腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐并伴有發(fā)熱等癥狀。副溶血弧菌除了給人類健康帶來巨大危害,還給海產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。耐熱直接溶血素(TDH)、耐熱相關(guān)溶血素(TRH)、Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)、Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)和黏附素等是副溶血弧菌常見的毒力因子,此外運動性也和副溶血弧菌的毒力相關(guān)。其中Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)與副溶血弧菌的腸毒性有關(guān),其分泌的效應(yīng)蛋白在副溶血弧菌的致病性發(fā)揮重要作用。幼兔模型常被用來研究副溶血弧菌腸道致病性,通過對其減毒機制進行研究,有望為副溶血弧菌感染的防控提供新視野、新思路。前期研究通過Tn-seq在幼兔模型體內(nèi)試驗成功篩選出副溶血弧菌230個減毒基因,其中包括VP0058(gntR)。本研究通過同源重組的方法構(gòu)建ΔgntR缺失株、質(zhì)�；匮a株,用幼兔模型模擬腸道感染進行驗證,通過一系列的體外實驗對ΔgntR缺失株的生物學特性進行評價,進一步通過RNA-seq的方法篩選GntR蛋白的下游調(diào)...

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
符號說明
綜述 副溶血弧菌的致病性和葡萄糖酸鹽代謝途徑
    1 副溶血弧菌毒力因子
        1.1 溶血素
        1.2 Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)
        1.3 Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)
        1.4 黏附素
    2 副溶血弧菌葡萄糖酸鹽代謝途徑
        2.1 葡萄糖酸鹽
        2.2 病原菌和宿主的相互作用
        2.3 葡萄糖酸鹽利用系統(tǒng)
        2.4 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子GntR
    3 展望
第一章 副溶血弧菌ΔgntR突變株的構(gòu)建和生物學特性鑒定
    1 材料
        1.1 菌株和質(zhì)粒
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器
        1.4 實驗動物
        1.5 引物設(shè)計
    2 方法
        2.1 突變株構(gòu)建
            2.1.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建
            2.1.2 重組質(zhì)粒的鑒定
            2.1.3 接合轉(zhuǎn)化
            2.1.4 單交換菌株鑒定
            2.1.5 突變株鑒定
        2.2 回補株和蛋白表達菌株構(gòu)建
            2.2.1 菌株構(gòu)建
            2.2.2 Western blot
        2.3 過表達菌株構(gòu)建
        2.4 毒力實驗
        2.5 生長曲線測定,運動性和酸應(yīng)激試驗
        2.6 統(tǒng)計學分析
    3 結(jié)果及分析
        3.1 目的基因同源臂的擴增和拼接
        3.2 重組質(zhì)粒的鑒定
        3.3 同源重組和突變株鑒定
        3.4 回補株和蛋白表達菌株及過表達菌株構(gòu)建
        3.5 毒力試驗
        3.6 生長曲線、運動性試驗
        3.7 酸應(yīng)激試驗
    4 討論及展望
第二章 GntR轉(zhuǎn)錄調(diào)控葡萄糖酸鹽利用系統(tǒng)介導(dǎo)副溶血弧菌腸道定殖的分子機制
    1 材料
        1.1 菌株和質(zhì)粒
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器
    2 方法
        2.1 RNA-seq分析
        2.2 生物信息學分析
            2.2.1 同源性分析
            2.2.2 信號通路分析
            2.2.3 啟動子預(yù)測
        2.3 qRT-PCR
        2.4 LacZ報告基因的構(gòu)建和半乳糖苷酶檢測
        2.5 GntR蛋白純化和凝膠遷移阻滯試驗(EMSA)
        2.6 M9培養(yǎng)基補充碳源培養(yǎng)試驗
        2.7 過表達菌株生長曲線測定
    3 結(jié)果及分析
        3.1 RNA-seq分析
        3.2 生物信息學分析
        3.3 RT-PCR檢測副溶血弧菌葡萄糖酸鹽利用基因表達情況
        3.4 β-半乳糖苷酶測定
        3.5 凝膠遷移阻滯實驗結(jié)果（EMSA)
        3.6 M9培養(yǎng)基碳源補充培養(yǎng)試驗
        3.7 過表達菌株生長曲線測定
    4 討論及展望
全文總結(jié)
參考文獻
攻讀學位期間取得的研究成果
致謝



本文編號：3995412