哺乳動物卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育受眾多信號通路以及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。卵母細(xì)胞的成熟需要經(jīng)過兩次減數(shù)分裂過程,在減數(shù)分裂過程中,MAPK信號通路參與了調(diào)控紡錘體的組裝和染色體的正常排列。受精后的胚胎即進入著床前發(fā)育階段,該階段包括兩個關(guān)鍵過程,一個是合子基因組激活,該過程是由母源調(diào)控向胚胎調(diào)控轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵時期。早期胚胎發(fā)育的另一個重要過程是桑椹胚-囊胚轉(zhuǎn)換,該過程會出現(xiàn)內(nèi)細(xì)胞團以及滋養(yǎng)層的分化。轉(zhuǎn)錄因子以及表觀修飾因子在這兩個過程中發(fā)揮著重要作用。發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵調(diào)控因子在卵母細(xì)胞成熟或早期胚胎發(fā)育中所發(fā)揮的作用是揭示發(fā)育過程復(fù)雜性和系統(tǒng)性的基礎(chǔ)。甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶II(MATII)是哺乳動物體內(nèi)進行甲硫氨酸代謝的關(guān)鍵復(fù)合物,它是由催化亞基α以及調(diào)控亞基β組成。其中,α亞基是由MAT2A基因編碼而成;β亞基是由MAT2B基因編碼而成。該復(fù)合物通過催化甲硫氨酸形成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)進而與機體轉(zhuǎn)甲基代謝通路緊密相關(guān),同時SAM也是生物體內(nèi)甲基基團的最主要來源。MAT2A和MAT2B蛋白廣泛分布于生物體的多種細(xì)胞類型中,參與了體內(nèi)眾多DNA與組蛋白甲基化修飾。本研究通過篩選及功能分析,對MAT2A...

【文章頁數(shù)】：122 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞
綜述部分
    第一章 卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育
        1.1 卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程及調(diào)控機制
            1.1.1 卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程
            1.1.2 卵母細(xì)胞減數(shù)分裂調(diào)控
        1.2 早期胚胎發(fā)育的合子基因組激活
            1.2.1 合子基因組激活的時間
            1.2.2 合子基因組激活的機制
            1.2.3 母源mRNA的翻譯
            1.2.4 母源mRNA的清除
            1.2.5 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子
            1.2.6 染色質(zhì)重塑
        1.3 囊胚的形成和發(fā)育
            1.3.1 致密化和極化的發(fā)生
            1.3.2 內(nèi)細(xì)胞團和滋養(yǎng)層的形成
            1.3.3 囊胚期組蛋白修飾
    第二章 MAT2A及 MAT2B的研究進展
        2.1 MAT2A研究進展
        2.2 MAT2B研究進展
        2.3 甲硫氨酸代謝調(diào)控
        2.4 甲硫氨酸代謝與DNA甲基化
        2.5 早期胚胎發(fā)育的甲硫氨酸供給
        2.6 研究目的和意義
試驗部分
    第三章 MAT2A和MAT2B在HEPG2及LO2細(xì)胞中的表達和定位
        3.1 材料和試劑
            3.1.1 主要材料
            3.1.2 主要試劑
        3.2 方法
            3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            3.2.2 RNA提取
            3.2.3 反轉(zhuǎn)錄與實時熒光定量PCR
            3.2.4 基因擴增與載體構(gòu)建
            3.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            3.2.6 細(xì)胞免疫熒光染色
            3.2.7 蛋白免疫印跡檢測
            3.2.8 統(tǒng)計分析
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 MAT2A和MAT2B在HepG2以及LO2細(xì)胞系中的表達
            3.3.2 MAT2A和MAT2B在HepG2以及LO2細(xì)胞系中的定位
            3.3.3 MAT2A和MAT2B過表達影響其亞細(xì)胞分布
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
    第四章 MAT2B調(diào)控小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟
        4.1 材料和試劑
            4.1.1 主要材料
            4.1.2 主要試劑
        4.2 方法
            4.2.1 卵母細(xì)胞及受精卵的采集和培養(yǎng)
            4.2.2 卵母細(xì)胞顯微注射
            4.2.3 胚胎實時熒光定量PCR
            4.2.4 胚胎免疫熒光染色
            4.2.5 MAT2B及 GIT1 過表達載體構(gòu)建
            4.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)
            4.2.7 蛋白質(zhì)免疫共沉淀
            4.2.8 統(tǒng)計分析
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 MAT2B在卵母細(xì)胞期高表達
            4.3.2 敲降MAT2B對卵母細(xì)胞成熟的影響
            4.3.3 MAT2B與 GIT1 互作并激活MAPK通路
            4.3.4 U0126 處理對卵母細(xì)胞成熟的影響
            4.3.5 敲降MAT2B影響紡錘體排列和母源mRNA降解
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
    第五章 MAT2A在小鼠合子基因組激活中的功能研究
        5.1 材料和試劑
            5.1.1 主要材料
            5.1.2 主要試劑
        5.2 方法
            5.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            5.2.2 組織RNA提取
            5.2.3 小鼠卵母細(xì)胞及胚胎的采集與培養(yǎng)
            5.2.4 mRNA反轉(zhuǎn)錄
            5.2.5 蛋白免疫印跡檢測
            5.2.6 胚胎顯微注射
            5.2.7 胚胎免疫熒光染色
            5.2.8 胚胎實時熒光定量PCR
            5.2.9 體外轉(zhuǎn)錄
            5.2.10 胚胎轉(zhuǎn)錄活性檢測
        5.3 結(jié)果
            5.3.1 MAT2A及 MAT2B在小鼠多組織中的表達模式
            5.3.2 MAT2A及 MAT2B在小鼠卵母細(xì)胞及早期胚胎中的表達模式
            5.3.3 免疫熒光檢測MAT2A在小鼠早期胚胎中的分布模式
            5.3.4 MAT2A干擾RNA的驗證
            5.3.5 敲降MAT2A導(dǎo)致小鼠2-細(xì)胞胚胎阻滯
            5.3.6 敲降MAT2A對2-細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的影響
            5.3.7 胚胎發(fā)育挽救實驗
            5.3.8 細(xì)胞水平敲降MAT2A后影響組蛋白甲基化修飾
            5.3.9 敲降MAT2A后對2細(xì)胞胚胎組蛋白甲基化的影響
            5.3.10 敲降MAT2A后導(dǎo)致2細(xì)胞胚胎DNA損傷
        5.4 討論
        5.5 小結(jié)
    第六章 MAT2A在小鼠囊胚發(fā)育中的功能研究
        6.1 材料和試劑
            6.1.1 主要材料
            6.1.2 主要試劑
        6.2 方法
            6.2.1 小鼠胚胎獲取
            6.2.2 小鼠胚胎培養(yǎng)
            6.2.3 胚胎免疫熒光染色
            6.2.4 胚胎實時熒光定量PCR
            6.2.5 MAT2A催化位點突變載體構(gòu)建
            6.2.6 體外轉(zhuǎn)錄
            6.2.7 胚胎顯微注射
            6.2.8 胚胎凋亡染色
        6.3 結(jié)果
            6.3.1 環(huán)亮氨酸處理對胚胎發(fā)育的影響
            6.3.2 環(huán)亮氨酸處理對組蛋白甲基化修飾的影響
            6.3.3 甲硫氨酸饑餓培養(yǎng)對胚胎發(fā)育的影響
            6.3.4 甲硫氨酸饑餓培養(yǎng)對組蛋白甲基化修飾的影響
            6.3.5 MAT2A催化突變體對胚胎發(fā)育的影響
            6.3.6 抑制MAT2A催化活性對胚胎凋亡的影響
            6.3.7 抑制MAT2A催化活性對囊胚細(xì)胞數(shù)的影響
            6.3.8 抑制MAT2A催化活性對囊胚基因表達的影響
        6.4 討論
        6.5 小結(jié)
全文結(jié)論
創(chuàng)新點
不足之處和進一步研究計劃
參考文獻
附錄
致謝
個人簡歷



本文編號：4028455