溶菌酶能夠水解細菌細胞壁中β-1,4糖苷鍵,破壞細胞壁肽聚糖結構,是一種安全性高的藥品、飼料食品添加劑。市場上銷售的溶菌酶主要是從雞蛋清中提取。相比于雞溶菌酶,人溶菌酶(Human lysozyme,hLYZ)具有生物活性高、穩(wěn)定性好,具有較高的應用價值。受限于原料來源、提純精制成本等因素,人源溶菌酶制備量較少,不能滿足需求。本論文通過共表達分子伴侶Kar2p、ERO1p、轉錄因子Hac1p及優(yōu)化基因劑量,研究其對畢赤酵母KM71菌株表達人溶菌酶水平的影響,期望得到高效表達人溶菌酶的畢赤酵母基因工程菌株。(1)根據(jù)GenBank中Kar2p、ERO1p和Hac1p基因序列,設計引物,構建重組載體pG418-Kar2p、pG418-ERO1p和p9K-Hac1p。采用電擊轉化法,將構建的重組載體整合于含人溶菌酶基因的重組酵母菌株KM71-pPIC-hLYZ-3基因組中,在含G418的YPDS平板上篩選得到共表達分子伴侶Kar2p、ERO1p和人溶菌酶的工程菌株 KM71-pPIC-hLYZ-Kar2p-5、KM71-pPIC-hLYZ-ERO1p-7,以及共表達轉錄因子Hac1p和人溶菌酶...

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 緒論
    1.1 溶菌酶概述
        1.1.1 溶菌酶
        1.1.2 溶菌酶應用
        1.1.3 人源溶菌酶研究意義及現(xiàn)狀
    1.2 畢赤酵母表達系統(tǒng)
        1.2.1 畢赤酵母表達載體
        1.2.2 畢赤酵母表達宿主菌
        1.2.3 提高畢赤酵母表達外源蛋白的策略
    1.3 本課題研究研究內容
2 共表達Kar2p、ERO1p和Hac1p對hLYZ表達的影響
    2.1 材料
        2.1.1 菌株及質粒
        2.1.2 引物
        2.1.3 試劑及主要儀器
        2.1.4 培養(yǎng)基及試劑配制
    2.2 方法
        2.2.1 質粒提取
        2.2.2 PCR產物純化
        2.2.3 酶切DNA片段回收
        2.2.4 酵母基因組提取
        2.2.5 大腸桿菌DH5a感受態(tài)制備及轉化
        2.2.6 共表達分子伴侶Kar2p、ERO1p重組載體的構建及鑒定
        2.2.7 共表達轉錄因子Hac1p重組載體的構建及鑒定
        2.2.8 工程菌株構建
        2.2.9 共表達Kar2p、ERO1p和Hac1p的工程菌株搖瓶發(fā)酵
        2.2.10 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
        2.2.11 重組菌株生長曲線、胞外蛋白量及人溶菌酶活力的測定
    2.3 結果與討論
        2.3.1 重組載體的構建及鑒定
        2.3.2 共表達Kar2p、ERO1p及Hac1p的重組菌株構建
        2.3.3 共表達Kar2p、ERO1p和Hac1p對hLYZ表達的影響
        2.3.4 討論
    2.4 本章小結
3 基因劑量對hLYZ表達的影響
    3.1 材料
        3.1.1 菌株及質粒
        3.1.2 引物
        3.1.3 試劑及主要儀器
        3.1.4 培養(yǎng)基及試劑
    3.2 方法
        3.2.1 多拷貝串聯(lián)載體的構建及鑒定
        3.2.2 工程菌株構建
        3.2.3 定量PCR鑒定工程菌株hly基因拷貝數(shù)
        3.2.4 工程菌株搖瓶發(fā)酵
        3.2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
        3.2.6 重組菌株生長曲線、胞外蛋白量及人溶菌酶活力的測定
    3.3 結果與討論
        3.3.1 多拷貝串聯(lián)載體的構建及鑒定
        3.3.2 攜帶不同hly基因拷貝數(shù)的工程菌株構建
        3.3.3 定量PCR鑒定工程菌株hly基因拷貝數(shù)
        3.3.4 基因劑量對hLYZ表達的影響
        3.3.5 討論
    3.4 本章小結
4 共表達Hac1p對hLYZ表達的影響
    4.1 材料
        4.1.1 菌株及質粒
        4.1.2 引物
        4.1.3 試劑及主要儀器
        4.1.4 培養(yǎng)基及試劑
    4.2 方法
        4.2.1 工程菌株構建
        4.2.2 共表達Hac1p的工程菌株搖瓶發(fā)酵
        4.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
        4.2.4 重組菌株生長曲線、胞外蛋白量及人溶菌酶活力的測定
    4.3 結果與討論
        4.3.1 工程菌株構建
        4.3.2 共表達Hac1p對hLYZ表達的影響
        4.3.3 討論
    4.4 本章小結
5 結論與展望
    5.1 結論
    5.2 展望
參考文獻
致謝
攻讀學位期間的研究成果



本文編號：4044768