發(fā)布時(shí)間：2020-08-28 19:52

　　 第一部分馬拉色菌和人原代角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)液在寬譜中波紫外線影響下對人原代黑素細(xì)胞黑素合成的影響目的:建立球形馬拉色菌與人原代角質(zhì)形成細(xì)胞即HEKs細(xì)胞的共培養(yǎng)模型,并觀察共培養(yǎng)體系在或不在中波紫外線UVB暴露下對人原代黑素細(xì)胞即HEMs細(xì)胞的增殖、酪氨酸酶活性、酪氨酸蛋白酶在蛋白水平的合成及重要黑素合成通路蛋白的影響。方法:用CCK8方法檢測不同濃度球形馬拉色菌(CBS7966)對HEKs增殖率的影響,并利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析(RTCA)系統(tǒng)監(jiān)測不同濃度馬拉色菌對HEKs增殖曲線的影響,找到馬拉色菌與HEKs細(xì)胞共培養(yǎng)最佳比例,建立共培養(yǎng)模型。試驗(yàn)組分為六組,即HEKs單獨(dú)培養(yǎng)組;HEKs與馬拉色菌共培養(yǎng)組;HEKs單獨(dú)培養(yǎng)并接受15mJ/cm2UVB照射組;HEKs與馬拉色菌共培養(yǎng)并接受15mJ/cm2UVB照射組;HEKs單獨(dú)培養(yǎng)并接受75mJ/cm2UVB照射組;HEKs與馬拉色菌共培養(yǎng)并接受75mJ/cm2UVB照射組。收集上述六組上清,轉(zhuǎn)而培養(yǎng)原代黑素細(xì)胞即HEMs細(xì)胞,利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析(RTCA)系統(tǒng)監(jiān)測各組培養(yǎng)上清對HEMs細(xì)胞的增殖曲線影響,用多巴氧化法檢測各組培養(yǎng)上清對HEMs酪氨酸酶活性的影響;采用transwell小室共培養(yǎng)方法將上述各組細(xì)胞與HEMs細(xì)胞共培養(yǎng),Western-blot方法檢測HEMs酪氨酸蛋白酶TYR、酪氨酸相關(guān)蛋白酶1(TRP1),及重要相關(guān)通路蛋白MITF、磷酸化ERK及磷酸化CREB1的合成。結(jié)果:球形馬拉色菌與HEKs以比例1:1共培養(yǎng)時(shí),馬拉色菌不會(huì)干擾HEKs細(xì)胞增殖活性,但2.5:1及以上組均在一定時(shí)間后對HEKs細(xì)胞增殖活性產(chǎn)生顯著抑制作用(p0.05)。非紫外線暴露時(shí),各組對HEMs細(xì)胞的增殖,酪氨酸酶活性,TYR、TRP1、MITF、磷酸化ERK及磷酸化CREB1的蛋白合成均無顯著影響(p0.05)。低劑量(15 mJ/cm2)UVB照射后:球形馬拉色菌抑制了 HEKs培養(yǎng)上清對HEMs細(xì)胞的促增殖作用(p0.05);HEKs促進(jìn)了 HEMs細(xì)胞TRP1蛋白合成(p0.05),球形馬拉色菌對其促進(jìn)作用顯著無影響;球形馬拉色菌與HEKs共培養(yǎng)組及HEKs單獨(dú)培養(yǎng)組對TYR活性無顯著影響,對TYR、MITF、磷酸化ERK及磷酸化CREB1的蛋白合成無顯著影響(p0.05);高劑量(75mJ/cm2)UVB照射后:HEKs培養(yǎng)上清抑制了 HEMs增殖活性,而球形馬拉色菌對其抑制作用無顯著影響;球形馬拉色菌抑制了 HEKs培養(yǎng)上清對HEMs細(xì)胞酪氨酸酶活性的促進(jìn)作用,抑制了 HEKs培養(yǎng)上清對黑素合成通路蛋白TYR、TRP1、MITF、磷酸化ERK及磷酸化CREB1的促合成作用。結(jié)論:寬譜中波紫外線暴露下球形馬拉色菌通過與HEKs相互作用,抑制了HEKs細(xì)胞對HEMs細(xì)胞的促增殖作用、對酪氨酸酶活性的促進(jìn)作用、對TYR、TRP1、MITF、p-ERK及p-CREB1合成的促進(jìn)作用,可能對UVB暴露引起的色素沉著產(chǎn)生一定抑制作用。第二部分馬拉色菌在寬譜中波紫外線影響下對人角質(zhì)形成細(xì)胞合成分泌黑素合成相關(guān)細(xì)胞因子的影響第一章馬拉色菌在寬譜中波紫外線影響下對原代人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(HEKs)合成分泌黑素合成相關(guān)細(xì)胞因子的影響目的:觀察球形馬拉色菌對HEKs細(xì)胞分泌的一些黑素合成相關(guān)細(xì)胞因子的影響。并觀察不同強(qiáng)度UVB照射下馬拉色菌對這些因子產(chǎn)生的影響。方法:試驗(yàn)組分為六組,即HEKs單獨(dú)培養(yǎng)組;HEKs與馬拉色菌共培養(yǎng)組;HEKs單獨(dú)培養(yǎng)并接受15mJ/cm2UVB照射組;HEKs與馬拉色菌共培養(yǎng)并接受15mJ/cm2UVB照射組;HEKs單獨(dú)培養(yǎng)并接受75mJ/cm2UVB照射組;HEKs與馬拉色菌共培養(yǎng)并接受75mJ/cm2UVB照射組。通過ELISA方法檢測上述六組球形馬拉色菌與HEKs共培養(yǎng)體系及HEKs單獨(dú)培養(yǎng)組上清IL-1 α、IL-6、TNF-α、SCF、GM-CSF、b-FGF、EDN1、α-MSH、NT-3、PGE2蛋白表達(dá),用RT-PCR方法檢測細(xì)胞裂解液中上述細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)。結(jié)果:在非紫外線暴露時(shí),球形馬拉色菌可刺激HEKs細(xì)胞EDN1、PGE2、IL-1α蛋白及mRNA的表達(dá)(p0.05),對其他細(xì)胞因子無影響(p0.05)。紫外線 UVB 暴露下,HEKs 分泌的 IL-1α、IL-6、TNF-α、SCF、GM-CSF、b-FGF、EDN1、PGE2蛋白表達(dá)增加,COX-2、NT-3、POMCmRNA表達(dá)增加(NT-3,a-MSH只檢測到了 mRNA)(p0.05)。低劑量(15mJ/cm2)UVB照射條件下,球形馬拉色菌可進(jìn)一步刺激除TNF-α之外上述細(xì)胞因子的表達(dá),對TNF-α表達(dá)無影響。而在高劑量(75mJ/cm2)UVB照射條件下,除了進(jìn)一步刺激IL-1α、IL-6、GM-CSF蛋白及mRNA的表達(dá)之外,球形馬拉色菌抑制了 EDN1蛋白及mRNA、TNF-α蛋白及mRNA,COX-2、POMC、NT-3mRNA 的表達(dá)(p0.05),對 SCF 及 bFGF 蛋白及mRNA表達(dá)無影響(p0.05)。結(jié)論:非UVB暴露或低劑量UVB暴露下,球形馬拉色菌可刺激HEKs分泌促黑素合成細(xì)胞因子。在高劑量UVB暴露下,馬拉色菌可抑制HEKs分泌促黑素合成細(xì)胞因子,促進(jìn)HEKs分泌抑制黑素合成的部分細(xì)胞因子。第二章馬拉色菌在寬譜中波紫外線影響下對人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(hacat細(xì)胞)分泌黑素合成相關(guān)細(xì)胞因子的影響目的:建立球形馬拉色菌與hacat細(xì)胞的共培養(yǎng)模型,觀察球形馬拉色菌對hacat細(xì)胞分泌的一些黑素合成相關(guān)細(xì)胞因子的影響。并觀察不同強(qiáng)度UVB照射下馬拉色菌對這些因子產(chǎn)生的影響。方法:用CCK8方法檢測不同濃度球形馬拉色菌對hacat細(xì)胞增殖率的影響,并利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析(RTCA)系統(tǒng)監(jiān)測不同濃度馬拉色菌對hacat細(xì)胞增殖曲線的影響,找到馬拉色菌與HEKs細(xì)胞共培養(yǎng)最佳比例,建立共培養(yǎng)模型,并通過ELISA方法檢測不同劑量(0mJ/cm2,15mJ/cm2,75mJ/cm2)寬譜U-VB照射下球形馬拉色菌與hacat細(xì)胞共培養(yǎng)體系及hacat單獨(dú)培養(yǎng)組上清IL-1α、IL-6、TNF-α、b-FGF、ET-1、SCF、PGE2 蛋白表達(dá)。結(jié)果:hacat與馬拉色菌在1:1比例共培養(yǎng)時(shí),在48h內(nèi)會(huì)促進(jìn)hacat細(xì)胞增殖(p0.05)。而比例1:1時(shí),在72h內(nèi)對hacat細(xì)胞增殖無顯著影響(p0.05)。在一定劑量UVB暴露下,hacat單獨(dú)培養(yǎng)組細(xì)胞分泌的IL-1α、IL-6、TNF-α、ET-1、PGE2細(xì)胞因子蛋白濃度顯著增加(p0.05),而b-FGF和SCF分泌量無明顯變化(p0.05)。在15mJ/cm2UVB照射條件下,球形馬拉色菌促進(jìn)了 IL-1α蛋白分泌(p0.05),抑制了 IL-6、ET-1、TNF-α 蛋白分泌(p0.05),對 PGE2、b-FGF 和 SCF則無明顯影響(p0.05)。在75mJ/cm2UVB照射條件下,馬拉色菌對IL-6和TNF-α蛋白分泌蛋白分泌量有抑制作用(p0.05),而對其他細(xì)胞因子則無顯著影響(p0.05)。結(jié)論:球形馬拉色菌通過與hacat細(xì)胞相互作用,在不同紫外線照射條件下,對hacat細(xì)胞的黑素合成相關(guān)細(xì)胞因子分泌影響不同。在15mJ/cm2UVB暴露下,可抑制ET-1的蛋白分泌,可能抑制了紫外線暴露引起的色素沉著。但需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。第三部分不同來源的64株馬拉色菌ITS、特異區(qū)基因型特點(diǎn)目的:對64株不同地方來源的馬拉色菌(Pityrosporum)進(jìn)行ITS,b3和b6測序和演化分析。方法:收集來自南京、四川、上海和江西四個(gè)地區(qū)的64株馬拉色菌臨床株,提取DNA,并進(jìn)行ITS,b3和b6區(qū)PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物純化,測序后進(jìn)行序列分析,用mega構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果及結(jié)論:通過對Pityrosporum ITS、b3和b6序列的克隆、測序和序列分析,研究發(fā)現(xiàn)來自南京地區(qū)的Pityrosporum的單倍型和核苷酸多樣性都是最高的。Pityrosporum地域性和基因型沒有明顯的相關(guān)性,菌株的基因型和感染的部位也沒有明確的相關(guān)性,但是相同的Pityrosporum在基因型上差異又是比較大的,如南京地區(qū)分離的M.furfur,存在較大的基因多樣性。我們發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的菌株的多樣性高低不同,這可能與受到選擇壓力的影響有關(guān)。系統(tǒng)進(jìn)化顯示同種的菌株也存在較大的差異。通過用ITS、特異序列b3和b6的研究發(fā)現(xiàn),特異序列b6比ITS和b3更適合于研究Pityrosporum的基因多態(tài)性。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R756
【部分圖文】：

３．１邋ＨＥＫｓ細(xì)胞形態(tài)學(xué)逡逑取包皮后三天及一周時(shí)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)為多逡逑角形。（見圖１－１）逡逑ＩＨ逡逑圖１－１：邋ＨＥＫｓ原代培養(yǎng)鏡下形態(tài)，左圖為第３天形態(tài)，右圖為１周時(shí)形態(tài)逡逑（４0ｘ）逡逑３．２原代人表皮黑素細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)學(xué)及免疫熒光染色鑒定逡逑３．２．１原代人表皮黑素細(xì)胞培養(yǎng)鏡下形態(tài)學(xué)觀察逡逑黑素細(xì)胞培養(yǎng)３天后鏡下可見較多呈卵圓形生長不良的角質(zhì)形成細(xì)胞，其周逡逑邊僅有少量具２－４個(gè)樹枝狀突起的黑素細(xì)胞（圖１左）。黑素細(xì)胞開始時(shí)生長緩慢，逡逑角質(zhì)形成細(xì)胞逐漸減少。２周后，僅見少量角質(zhì)形成細(xì)胞殘留，黑素細(xì)胞則數(shù)量逡逑明顯增多，樹突及軸絲增長，呈梭形，樹突多為２－３個(gè)，中央細(xì)胞核折光性較強(qiáng)，逡逑成群網(wǎng)狀排列（圖１右）。逡逑ｍｕ逡逑圖１邋：ＨＥＭｓ原代培養(yǎng)鏡下形態(tài)，左圖為第３天形態(tài)，右圖為２周時(shí)形態(tài)（４0ｘ）逡逑３．２．２原代人表皮黑素細(xì)胞免疫熒光染色鑒定逡逑經(jīng)過ｍｅｌａｎＡ及Ｓ１００熒光染色后，可見細(xì)胞漿和細(xì)胞核被染成紅色（９０％逡逑以上細(xì)胞）

３．１邋ＨＥＫｓ細(xì)胞形態(tài)學(xué)逡逑取包皮后三天及一周時(shí)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)為多逡逑角形。（見圖１－１）逡逑ＩＨ逡逑圖１－１：邋ＨＥＫｓ原代培養(yǎng)鏡下形態(tài)，左圖為第３天形態(tài)，右圖為１周時(shí)形態(tài)逡逑（４0ｘ）逡逑３．２原代人表皮黑素細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)學(xué)及免疫熒光染色鑒定逡逑３．２．１原代人表皮黑素細(xì)胞培養(yǎng)鏡下形態(tài)學(xué)觀察逡逑黑素細(xì)胞培養(yǎng)３天后鏡下可見較多呈卵圓形生長不良的角質(zhì)形成細(xì)胞，其周逡逑邊僅有少量具２－４個(gè)樹枝狀突起的黑素細(xì)胞（圖１左）。黑素細(xì)胞開始時(shí)生長緩慢，逡逑角質(zhì)形成細(xì)胞逐漸減少。２周后，僅見少量角質(zhì)形成細(xì)胞殘留，黑素細(xì)胞則數(shù)量逡逑明顯增多，樹突及軸絲增長，呈梭形，樹突多為２－３個(gè)，中央細(xì)胞核折光性較強(qiáng)，逡逑成群網(wǎng)狀排列（圖１右）。逡逑ｍｕ逡逑圖１邋：ＨＥＭｓ原代培養(yǎng)鏡下形態(tài)，左圖為第３天形態(tài)，右圖為２周時(shí)形態(tài)（４0ｘ）逡逑３．２．２原代人表皮黑素細(xì)胞免疫熒光染色鑒定逡逑經(jīng)過ｍｅｌａｎＡ及Ｓ１００熒光染色后，可見細(xì)胞漿和細(xì)胞核被染成紅色（９０％逡逑以上細(xì)胞）

圖２：邋ｍｅｌａｎＡ及Ｓ１００焚光染色結(jié)果（上排三個(gè)圖為ｍｅｌａｎＡ染色結(jié)果，下逡逑排三個(gè)圖為Ｓ１００染色結(jié)果）逡逑３．３不同濃度馬拉色菌對ＨＥＫｓ細(xì)胞增殖率的影響（ＣＣＫ－８法）逡逑如圖１－２，共培養(yǎng)２４ｈ后，１：１比例組（ＨＥＫｓ：馬拉色菌）細(xì)胞增殖率要高于逡逑對照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｐ＞０．０５）。２４ｈ其余比例組、４８ｈ及７２ｈ各比例組細(xì)逡逑胞增殖率均小于對照組。７２ｈ內(nèi)１：１及１：１０比例組與對照組相比，馬拉色菌對逡逑ＨＥＫｓ細(xì)胞增殖率無影響。在培養(yǎng)４８ｈ、７２ｈ后，１：２０和１：４０比例組與對照組相逡逑比，ＨＥＫｓ增殖率受到顯著抑制（ｐ＜０．０５）。逡逑１５0ｉ逡逑＾邋ＫＣ逡逑５邐ｊ邐■邋１：１逡逑０邋ａｎｎ邐％邐＿邐Ｇ＾３邋１＇邋１０逡逑＾邐Ｉ媝自ｍ曑自＾W自虹ｒ邋ｓ邋１２０逡逑ｒａ１４０逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2808076