發(fā)布時(shí)間：2020-09-02 14:22

　　 研究目的:初步探究戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是否可以感染血小板,并促進(jìn)血小板的活化及外泌體的分泌。血小板分泌的外泌體是否能夠促進(jìn)HEV的傳播。研究方法:本研究通過建立HEV擴(kuò)增培養(yǎng)體系和HEV RNA qRT-PCR檢測(cè)方法,收集HEV病毒液并檢測(cè)HEV核酸濃度。將健康人洗滌血小板與HEV共培養(yǎng),運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)血小板中HEV RNA載量并繪制生長(zhǎng)曲線,間接免疫熒光法檢測(cè)血小板中HEV ORF2蛋白;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板表面CD41a和CD62p分子的表達(dá);運(yùn)用差速離心法和免疫磁珠法分離并純化HEV或PBS作用后的血小板分泌的外泌體,qRT-PCR和ELISA分別檢測(cè)兩組外泌體中HEV RNA和HEV抗原;將兩組外泌體感染PLC/PRF/5細(xì)胞,qRT-PCR和間接免疫熒光法分別檢測(cè)PLC/PRF/5 細(xì)胞中 HEV RNA 和 HEV ORF2 蛋白。研究結(jié)果:結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)HEV濃度為4×109copies/mL,共孵育時(shí)間為24h時(shí),血小板結(jié)合或內(nèi)化的病毒量最高為(2.34±0.39)×107 copies/mL;血小板在培養(yǎng)過程中,血小板結(jié)合或內(nèi)化的病毒總量,第1天低于第0天,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。在第1天至第5天,病毒載量基本穩(wěn)定在107copies/mL;隨著時(shí)間的增加,CD41a和CD62p雙陽(yáng)性細(xì)胞比例增加約10-20%。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn),實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組平均增加約4%(P0.01);與HEV孵育后的血小板分泌的外泌體中含有HEV核酸及蛋白組分,將陽(yáng)性外泌體感染PLC/PRF/5細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)PLC/PRF/5細(xì)胞中HEV核酸及蛋白呈陽(yáng)性反應(yīng)。研究結(jié)論:HEV可以進(jìn)入血小板,但HEV進(jìn)入血小板的機(jī)制及是否在血小板內(nèi)復(fù)制還需進(jìn)一步研究;HEV可以促進(jìn)血小板的活化及外泌體的分泌;經(jīng)HEV作用的血小板分泌的外泌體可以介導(dǎo)HEV在PLC/PRF/5細(xì)胞中的傳播。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R512.6
【部分圖文】：

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑ＨＥＶ邋ＲＮＡ邋ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)方法的建立逡逑標(biāo)準(zhǔn)品的制備逡逑Ｒ目的片段的獲取逡逑為日￡NB０３基因組的部分片段，全長(zhǎng)２６５卜口，１１丁１0１后１）：逡逑Ｍａｒｋｅｒ空白丨邋２邐３逡逑

Ｍａｒｋｅｒ空白丨邋２邐３逡逑２５０邐￣２６５邋ｂｐ逡逑■逡逑圖１邋ＲＴ－ＰＣＲ瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果逡逑組質(zhì)粒的鑒定逡逑用的是ｐＵＣｍ－Ｔ載體，大小為２７７３邋ｂｐ，目的片段大小為２粒，測(cè)序，與目的序列進(jìn)行序列比對(duì)。確定重組質(zhì)粒正確。逡逑粒的酶切與體外轉(zhuǎn)錄逡逑Ｓａｃｌ限制性內(nèi)切酶酶切，后檢測(cè)到約為２８００邋ｂｐ的條帶。結(jié)Ｍａｒｋｅｒ質(zhì)粒逡逑

１．２邋ｑＲＴ－ＰＣＲ反應(yīng)體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立逡逑１．２．１擴(kuò)增曲線圖逡逑將梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ反應(yīng)，得到擴(kuò)增曲線，見圖３。逡逑圖中各曲線拷貝數(shù)從左向右分別為１０１Ｇ、丨０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４、１０３逡逑ｃｏｐｉｅｓ／ｕｌ0逡逑Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋Ｐｌｏｔ逡逑１００００００逡逑１０００００邐邐邐邐逡逑產(chǎn)邋１００００邋２，＾７６．６８３３３６逡逑｜邋１000逡逑１邐：邐—＊邐：—：邐邐邐：—逡逑２邐４邐６邐８邐１０邋１２邋Ｕ邋１６邐１８邋２０邐２２邋２！邐２６邋２６邋３０邐３２邐３６邋３６邐４０逡逑Ｃｙｃｌｅ逡逑圖３重組質(zhì)粒ＲＮＡ標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線逡逑１．２．２標(biāo)準(zhǔn)曲線圖逡逑根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品理論拷貝數(shù)和Ｃｔ值，得到了以拷貝數(shù)（ｃｏｐｉｅｓ／此）為橫坐標(biāo)，循逡逑環(huán)數(shù)（Ｃｔ）為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖４）。據(jù)ＡＢＩ邋７５００邋ｓｏｆｔｗａｒｅ邋ｖ２．３，得到標(biāo)準(zhǔn)曲逡逑線斜率為－３．５０８，截距為４８．４７２，相關(guān)系數(shù)為０．９９９，回歸公式為：ｙ＝－逡逑３．５０８ｒ＋４８．４７２0逡逑Ｓｔａｎｄａｒｄ邋Ｃｕｒｖｅ逡逑３５逡逑３０逡逑0邋２５逡逑ｊ逡逑１５邐邋５逡逑１００邋２０Ｄ邋削邐１＜Ｕ３０邐１００００３邋ＫＯＣＤＸｌ邋ＩＯＵＸＩｌＩＯ邋ＩＱＸｌＸＯＸｌ邋１ＣＤ３０ＤＸＣＩ邋ｔＯＯＸＯＣｍＣＯ邋ｌＯＯＣＯＸｌＯ逡逑Ｑｕａｎｔｉｔｙ逡逑圖４重組質(zhì)粒ＲＮＡ標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線逡逑１．２．３重復(fù)性評(píng)價(jià)逡逑通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)拷貝數(shù)，計(jì)算拷貝數(shù)的平均值、方差和變異系數(shù)。統(tǒng)逡逑計(jì)結(jié)果顯示

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本文編號(hào)：2810711