研究目的:初步探究戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是否可以感染血小板,并促進血小板的活化及外泌體的分泌。血小板分泌的外泌體是否能夠促進HEV的傳播。研究方法:本研究通過建立HEV擴增培養(yǎng)體系和HEV RNA qRT-PCR檢測方法,收集HEV病毒液并檢測HEV核酸濃度。將健康人洗滌血小板與HEV共培養(yǎng),運用qRT-PCR檢測血小板中HEV RNA載量并繪制生長曲線,間接免疫熒光法檢測血小板中HEV ORF2蛋白;流式細胞術(shù)檢測血小板表面CD41a和CD62p分子的表達;運用差速離心法和免疫磁珠法分離并純化HEV或PBS作用后的血小板分泌的外泌體,qRT-PCR和ELISA分別檢測兩組外泌體中HEV RNA和HEV抗原;將兩組外泌體感染PLC/PRF/5細胞,qRT-PCR和間接免疫熒光法分別檢測PLC/PRF/5 細胞中 HEV RNA 和 HEV ORF2 蛋白。研究結(jié)果:結(jié)果發(fā)現(xiàn)當HEV濃度為4×109copies/mL,共孵育時間為24h時,血小板結(jié)合或內(nèi)化的病毒量最高為(2.34±0.39)×107 copies/mL;血小板在培養(yǎng)過程中,血小板結(jié)合或內(nèi)化的病毒總量,第1天低于第0天,差異有統(tǒng)計學意義(P0.001)。在第1天至第5天,病毒載量基本穩(wěn)定在107copies/mL;隨著時間的增加,CD41a和CD62p雙陽性細胞比例增加約10-20%。在每個時間點,實驗組比對照組平均增加約4%(P0.01);與HEV孵育后的血小板分泌的外泌體中含有HEV核酸及蛋白組分,將陽性外泌體感染PLC/PRF/5細胞后發(fā)現(xiàn)PLC/PRF/5細胞中HEV核酸及蛋白呈陽性反應。研究結(jié)論:HEV可以進入血小板,但HEV進入血小板的機制及是否在血小板內(nèi)復制還需進一步研究;HEV可以促進血小板的活化及外泌體的分泌;經(jīng)HEV作用的血小板分泌的外泌體可以介導HEV在PLC/PRF/5細胞中的傳播。
【學位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R512.6
【部分圖文】：

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院碩士學位論文四、實驗結(jié)果逡逑ＨＥＶ邋ＲＮＡ邋ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測方法的建立逡逑標準品的制備逡逑Ｒ目的片段的獲取逡逑為日￡NB０３基因組的部分片段，全長２６５卜口，１１�。�0１后１）：逡逑Ｍａｒｋｅｒ空白丨邋２邐３逡逑

Ｍａｒｋｅｒ空白丨邋２邐３逡逑２５０邐￣２６５邋ｂｐ逡逑■逡逑圖１邋ＲＴ－ＰＣＲ瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果逡逑組質(zhì)粒的鑒定逡逑用的是ｐＵＣｍ－Ｔ載體，大小為２７７３邋ｂｐ，目的片段大小為２粒，測序，與目的序列進行序列比對。確定重組質(zhì)粒正確。逡逑粒的酶切與體外轉(zhuǎn)錄逡逑Ｓａｃｌ限制性內(nèi)切酶酶切，后檢測到約為２８００邋ｂｐ的條帶。結(jié)Ｍａｒｋｅｒ質(zhì)粒逡逑

１．２邋ｑＲＴ－ＰＣＲ反應體系及標準曲線的建立逡逑１．２．１擴增曲線圖逡逑將梯度稀釋的標準品進行實時熒光定量ＰＣＲ反應，得到擴增曲線，見圖３。逡逑圖中各曲線拷貝數(shù)從左向右分別為１０１Ｇ、丨０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４、１０３逡逑ｃｏｐｉｅｓ／ｕｌ0逡逑Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋Ｐｌｏｔ逡逑１００００００逡逑１０００００邐邐邐邐逡逑產(chǎn)邋１００００邋２，＾７６．６８３３３６逡逑｜邋１000逡逑１邐：邐—＊邐：—：邐邐邐：—逡逑２邐４邐６邐８邐１０邋１２邋Ｕ邋１６邐１８邋２０邐２２邋２！邐２６邋２６邋３０邐３２邐３６邋３６邐４０逡逑Ｃｙｃｌｅ逡逑圖３重組質(zhì)粒ＲＮＡ標準品擴增曲線逡逑１．２．２標準曲線圖逡逑根據(jù)標準品理論拷貝數(shù)和Ｃｔ值，得到了以拷貝數(shù)（ｃｏｐｉｅｓ／此）為橫坐標，循逡逑環(huán)數(shù)（Ｃｔ）為縱坐標的標準曲線（圖４）。據(jù)ＡＢＩ邋７５００邋ｓｏｆｔｗａｒｅ邋ｖ２．３，得到標準曲逡逑線斜率為－３．５０８，截距為４８．４７２，相關(guān)系數(shù)為０．９９９，回歸公式為：ｙ＝－逡逑３．５０８ｒ＋４８．４７２0逡逑Ｓｔａｎｄａｒｄ邋Ｃｕｒｖｅ逡逑３５逡逑３０逡逑0邋２５逡逑ｊ逡逑１５邐邋５逡逑１００邋２０Ｄ邋削邐１＜Ｕ３０邐１００００３邋ＫＯＣＤＸｌ邋ＩＯＵＸＩｌＩＯ邋ＩＱＸｌＸＯＸｌ邋１ＣＤ３０ＤＸＣＩ邋ｔＯＯＸＯＣｍＣＯ邋ｌＯＯＣＯＸｌＯ逡逑Ｑｕａｎｔｉｔｙ逡逑圖４重組質(zhì)粒ＲＮＡ標準品標準曲線逡逑１．２．３重復性評價逡逑通過標準曲線計算相應拷貝數(shù)，計算拷貝數(shù)的平均值、方差和變異系數(shù)。統(tǒng)逡逑計結(jié)果顯示

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