發(fā)布時間：2020-09-02 18:35

　　 目的:了解結(jié)核分枝桿菌臨床分離株耐對氨基水楊酸(PAS)相關(guān)基因的突變頻率以及與結(jié)核分枝桿菌藥敏表型的相關(guān)性,為耐PAS相關(guān)基因分子檢測提供實驗室數(shù)據(jù),并為耐藥結(jié)核病的治療提供參考。方法:收集2015年3月至2018年3月肺結(jié)核患者臨床標本進行抗酸染色、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥物敏感試驗,獲得226例有藥敏結(jié)果的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株,其中敏感120例和耐藥106例。利用CTAB法提取上述菌株的DNA,分別對耐PAS相關(guān)基因thyA、folC和ribD進行PCR和基因測序,并與結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv序列進行分析比對,獲取PAS耐藥相關(guān)基因的突變位點,并與PAS藥敏表型比較。結(jié)果:本研究分別對耐PAS相關(guān)基因thyA、folC和ribD進行PCR擴增和測序分析。226例臨床分離株,thyA基因分析215例臨床分離株,其中敏感株111例,耐藥株104例,PAS表型敏感株212例,PAS表型耐藥株3例。215例中4例發(fā)生thyA基因突變,總突變率1.9%(4/215),其中3例為耐藥株,突變率2.9%(3/104),突變形式ACC22GCC(Thr22Ala)、CAC75AAC(His75Asn)和CAA97CGA(Gln97Arg),ACC22GCC為新突變,已上報GenBank,基因庫號:MK674466;1例為敏感株,突變率0.9%(1/111),突變形式TAC164AAC(Tyr164Asn)。在PAS表型敏感株中突變率1.4%(3/212),在PAS表型耐藥株中的突變率33.3%(1/3)。226例臨床分離株,folC基因分析216例臨床分離株,其中敏感株118例,耐藥株98例,PAS表型敏感株212例,PAS表型耐藥株4例。216例中2例發(fā)生folC基因突變,總突變率0.9%(2/216),均為耐藥株,突變率2.0%(2/98),突變形式GGT206AGT(Gly206Ser)和GCC325GTC(Ala325Val),GGT206AGT為新突變,已上報GenBank,基因庫號:MK674459;在PAS表型敏感株中突變率0.9%(2/212),在PAS表型耐藥株中未檢測到folC基因突變。226例臨床分離株,ribD基因分析206例臨床分離株,其中敏感111例,耐藥95例,PAS表型敏感株203例,PAS表型耐藥株3例,僅1例發(fā)生ribD基因突變,總突變率0.5%(1/206),為耐藥株,突變率1.1%(1/95),突變形式ACC245GCC(Thr245Ala)。在PAS表型敏感株中突變率0.9%(1/203),在PAS表型耐藥株中未檢測到ribD基因突變。結(jié)論:本研究所檢測到的thyA基因ACC22GCC(Thr22Ala)、CAC75AAC(His75Asn)和CAA97CGA(Gln97Arg)突變,folC基因GGT206AGT(Gly206Ser)和GCC325GTC(Ala325Val)突變及ribD基因的ACC245GCC(Thr245Ala)突變與耐異煙肼及耐多藥密切相關(guān),提示這些基因的突變可能與異煙肼存在交叉耐藥;thyA基因ACC22GCC突變與PAS耐藥相關(guān),其余的突變與PAS表型耐藥無明顯關(guān)系。該研究發(fā)現(xiàn)thyA基因ACC22GCC(Thr22Ala)和folC基因GGT206AGT(Gly206Ser)的2個新突變位點。
【學位單位】：遵義醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R52
【部分圖文】：

圖 1 ND-1000 檢測結(jié)核分枝桿菌 DNA 濃度 擴增結(jié)核分枝桿菌 thyA 基因全長和測序分析增 thyA 基因并驗證.tb 臨床分離株中，thyA 基因全長全部擴增，并經(jīng)凝膠電泳成92 bp 位置出現(xiàn)目的條帶（圖 2 ）。

31圖 2 結(jié)核分枝桿菌臨床分離株 thyA 基因全長 PCR 產(chǎn)物凝膠圖注：2%瓊脂糖凝膠 M：1000 bp Marker 陰：陰性對照 H2O1～13：結(jié)核分枝桿菌臨床分離株hyA 基因突變圖譜及序列分析thyA 基因測序結(jié)果在 NCBI 中和 H37Rv 標準序列進行比對分析，得序圖譜及突變后的全基因序列如下。

圖 3 thyA 基因 64 位點突變測序圖譜基因序列標注上下游引物及 A64G 位點如下，下劃線加粗為上下粗為突變后的堿基。ATACGAGGACCTGCTGCGCTTCGTGCTCGAAACGGGTACCGCGCCGGCACCGGAACCCGCAGCCTGTTCGGCCAGCAGTCGGCCGGTTTCCCGCTGCTCACTACCAAGAAAGTCCATTTACGAGCTGCTGTGGTTTTTGCGCGGCGATTCCAATATCGGACGGAGTCACCATCTGGGACGAATGGGCAAGTGATACAGATCTACGGTGTACAATGGCGATCGTGGCCGGCTCCATCCGGCAGATCAGCGCGGCGCTGGATTTGCTGCGCACCGATCCCGATCGTGTCGGCCTGGAACGTCGGCGAAATCGAGCGGATGGTCATGCGTTCTTCCAGTTCTACGTCGCCGATGGCCGGCTGACCAACGCAGCGCCGACCTGTTTCTGGGTGTGCCGTTCAAC

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本文編號：2810951