研究目的:擬根據(jù)HBV(Hepatitis B virus,HBV)感染細胞的關(guān)鍵事件,探討家蠅抗菌肽Cecropin(Musca domestica cecropin,MDC)抗HBV感染作用機制;外泌體作為細胞間交流的新方式,可攜帶病毒感染相關(guān)生物學信息,對病毒感染最終的結(jié)局有著重要的影響,本實驗旨在探索HepG2.2.15細胞上清來源的外泌體是否介導HBV感染,MDC是否干預(yù)外泌體介導的HBV感染過程。研究方法:1.家蠅抗菌肽Cecropin抗HBV作用機制研究:(1)Hi-Trap肝素親和層析柱法純化HBV顆粒;電鏡負染觀察HBV形態(tài)。(2)MTT實驗檢測藥物對HepaRG細胞增殖影響;12天感染實驗中利用Real-time PCR實驗檢測MDC對HBV黏附/進入及進入后階段的影響;激光共聚焦顯微鏡及流式細胞術(shù)檢測HBV黏附細胞階段加入藥物對感染率的影響;MTT實驗檢測藥物對HepG2.2.15細胞毒性作用,Real-time PCR、ELISA、激光共聚焦顯微鏡及Western blotting檢測MDC對HepG2.2.15細胞內(nèi)HBV復制的影響。(3)激光共聚焦顯微鏡觀察MDC在細胞內(nèi)分布及定位;Real-time PCR、Western blotting檢測MDC對JAK/STAT信號通路的影響。2、家蠅抗菌肽Cecropin抑制外泌體介導的HBV感染作用研究:(1)試劑盒提取HepG2.2.15細胞上清中外泌體(HepG2.2.15-EXO);電鏡負染檢測外泌體形態(tài),納米顆粒跟蹤分析儀檢測外泌體粒徑,Western blotting檢測外泌體標志性蛋白,PCR技術(shù)檢測外泌體是否含HBV核酸成分;超高分辨率活細胞3D顯微成像儀觀察外泌體在細胞內(nèi)的定位;(2)流式細胞術(shù)檢測外泌體在細胞中的擴散與傳遞,ELISA,Real-time PCR,ICC,Western blotting檢測HepG2.2.15-EXO是否介導HBV的感染,及探討MDC是否干預(yù)外泌體介導的HBV感染;(3)流式細胞術(shù)檢測外泌體濃度、共同孵育時間溫度、肝素及肝素酶對外泌體在細胞間擴散傳遞的影響;Real-time PCR檢測肝素及肝素酶對細胞內(nèi)HBV-DNA的表達影響;研究結(jié)果:1、家蠅抗菌肽Cecropin抗HBV作用機制研究:(1)電鏡觀察顯示MDC作用后HBV顆粒結(jié)構(gòu)破壞,并發(fā)生凝集反應(yīng);(2)在HBV攻擊細胞前或后加入藥物干預(yù),結(jié)果顯示MDC能使細胞HBV相關(guān)指標(細胞內(nèi)HBV-DNA,HBVcccDNA,pgRNA含量)降低,在HBV的黏附/進入及進入后階段均發(fā)揮了抑制作用;MDC可顯著降低HepG2.2.15細胞上清中HBsAg、HBeAg抗原及HBV DNA含量,細胞內(nèi)HBsAg、HBcAg蛋白含量,具有抑制HBV復制作用。(3)激光共聚焦顯微鏡觀察顯示MDC作用位點主要在細胞膜,細胞質(zhì)及細胞核也有結(jié)合;且MDC能激活JAK/STAT抗病毒信號通路,發(fā)揮抗病毒作用。2、家蠅抗菌肽Cecropin抑制外泌體介導的HBV感染作用研究:(1)對試劑盒法提取的外泌體,進行電鏡形態(tài)學檢測,納米顆粒跟蹤技術(shù)的粒徑檢測,及外泌體標志性蛋白檢測,確定提取的為外泌體,可以進行后續(xù)實驗;PCR技術(shù)核酸檢測顯示外泌體中存在HBV核酸;(2)流式細胞術(shù)、ELISA、ICC、Western blotting及Real-time PCR實驗結(jié)果顯示經(jīng)外泌體共同孵育的正常肝細胞HBV呈陽性表達,而家蠅抗菌肽Cecropin作用后,上述細胞內(nèi)HBV相關(guān)指標的表達顯著降低;(3)外泌體濃度、共同孵育時間、共同孵育溫度、肝素、肝素酶對外泌體在細胞間擴散傳遞有一定影響。結(jié)論:家蠅抗菌肽Cecropin可破壞HBV病毒顆粒結(jié)構(gòu),并使其發(fā)生凝聚;此外其對HBV病毒生命周期中的黏附/進入階段及進入后的復制階段均有抑制作用;MDC可通過激活抗病毒信號通路,發(fā)揮其抗病毒作用;提示MDC抗HBV作用機制復雜,涉及多個靶點;此外HepG2.2.15細胞上清來源的外泌體可介導HBV感染,而MDC對外泌體介導的HBV感染具有顯著抑制作用。
【學位單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

圖 1-1 HBV 生命周期圖1.1.2 外泌體外泌體是一種可以由大多數(shù)細胞所分泌的，直徑約為 30-150 nm 的微小囊泡，其表面結(jié)構(gòu)富含脂類物質(zhì)，其內(nèi)可攜帶多種核酸、蛋白質(zhì)等生物信息[20-21]。外泌體穿梭在細胞與細胞間，扮演著物質(zhì)運輸與信息交流的作用，參與到多種生理學及病理學過程，如細胞生長增殖分化，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及疾病細胞間物質(zhì)運輸?shù)萚22-23]。有研究報道，外泌體在肝臟疾病中也發(fā)揮著重要作用[24-25]。在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，外泌體所攜帶的相關(guān)核酸、蛋白等成分也發(fā)生相應(yīng)的改變，因此，外泌體在肝臟疾病進程中也有望被用作生物標記物，來指導肝臟疾病的診斷治療[26]。其發(fā)揮交流溝通的機制可能是外泌體與靶細胞相關(guān)受體結(jié)合、內(nèi)含物改變受體細胞微環(huán)境、最終調(diào)節(jié)細胞的生理進程。因此加強對細胞外排的外泌體的探討，對進一步了解原分泌細胞的生物學活性及指導疾病診斷治療有重要意義[27]。外泌體由原細胞分泌釋放到外環(huán)境中，通過各種途徑被靶細胞所吸收，這個過程并非隨機發(fā)生，細胞特異性是否參與到其中的特異性吸收過程，也仍是研究的一個方向[28]。

廣東藥科大學碩士研究生學位論文結(jié)果蠅抗菌肽 Cecropin 直接作用于病毒顆粒集 HepG2.2.15 細胞培養(yǎng)過程中的細胞上清，每 100 mL 上清按操，純化過程及定量結(jié)果分別見圖 2-2、表 2-1。HBV 顆粒與濃度為菌肽 Cecropin（MDC）直接作用后，病毒顆粒的形態(tài)變化如圖 2，HBV 顆粒表面結(jié)構(gòu)遭到破壞，并且家蠅抗菌肽 Cecropin 處理組。

廣東藥科大學碩士研究生學位論文原細胞上清 肝素管純化液 第一次超濾液 第二次超濾液1 M NaCl 20 mMTris-HCl 第二管1 M NaCl 20 mMTris-HCl 第二管1 M NaCl 20 mMTris-HCl 第二管體積 100 mL 50 mL 1.8 mL 0.8 mLHBVcopies/μl1912 200.2 158.4 稀釋 10 倍后為 502.41 M NaCl 20 mMTris-HCl 第一三管1 M NaCl 20 mMTris-HCl 第一三管1 M NaCl 20 mMTris-HCl 第一三管體積 100 mL 5.8 mL 1.2 mLHBVcopies/μl135.2 901.3 稀釋 10 倍后為 743
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本文編號：2861006