偽狂犬病(Pseudorabies)是由偽狂犬病病毒引起的多種家畜和野生動物以發(fā)熱、奇癢(豬除外)、腦脊髓炎、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)障礙為主要癥狀的一種急性傳染病。豬是PRV的天然宿主,也是本病的長期貯存宿主和排毒者。偽狂犬病病毒可以在感染后存活下來的豬中建立潛伏感染。由于受到外界環(huán)境變化或者身體受到應(yīng)激,處于潛伏感染狀態(tài)的偽狂犬病病毒可以被激活并且釋放至環(huán)境中,從而感染其他動物,導(dǎo)致偽狂犬病病毒長期存在豬群中,難以根除。PRV在潛伏感染時病毒基因組不復(fù)制,也不表達病毒蛋白,僅大量轉(zhuǎn)錄病毒潛在相關(guān)轉(zhuǎn)錄物(Latency-associated transcript,LATs)。目前有關(guān)LATs基因在PRV潛伏感染期是如何進行表達的尚不清楚,但是根據(jù)已有的報道涉及到兩個啟動子LAP1和LAP2。因此本研究利用偽狂犬病病毒BAC克隆和galk負(fù)篩選技術(shù)成功構(gòu)建了一批有關(guān)兩個啟動子缺失的病毒:包括LAP1/2均缺失的突變病毒JS-US和JS-RS;LAP1/2缺失并加入轉(zhuǎn)錄終止序列BGH的突變病毒JS-UBS;LAP1/2缺失并添加絕緣子c HS4和轉(zhuǎn)錄終止序列BGH的突變病毒JS-U1CBS和JS...

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 偽狂犬病簡介
        1.1.1 病毒的命名
        1.1.2 偽狂犬病的臨床特征
        1.1.3 流行病學(xué)
    1.2 偽狂犬病病毒的結(jié)構(gòu)特點和基因組特征
        1.2.1 結(jié)構(gòu)特點
        1.2.2 病毒基因組
    1.3 潛伏感染
        1.3.1 PRV的強神經(jīng)嗜性
        1.3.2 PRV潛伏感染時基因表達情況
        1.3.3 PRV潛伏活性啟動子
        1.3.4 潛伏感染模型的研究進展
    1.4 毒力基因UL23(TK基因)
        1.4.1 TK基因的結(jié)構(gòu)
        1.4.2 TK基因?qū)Σ《径玖Φ挠绊?br>        1.4.3 TK基因?qū)RV潛伏感染的影響
    1.5 本研究的目的和意義
第二章 潛伏活性啟動子LAP1/2缺失病毒的構(gòu)建
    2.1 材料與方法
        2.1.1 細胞、質(zhì)粒和菌株
        2.1.2 引物設(shè)計
        2.1.3 啟動子缺失病毒相關(guān)轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
        2.1.4 負(fù)篩選
        2.1.5 突變病毒拯救
        2.1.6 病毒滴度測定
        2.1.7 突變病毒一步生長曲線
        2.1.8 突變病毒的空斑試驗
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 突變病毒JS-US的構(gòu)建
        2.2.2 突變病毒JS-UBS的構(gòu)建
        2.2.3 突變病毒JS-U1CBS的構(gòu)建
        2.2.4 突變病毒JS-U2CBS的構(gòu)建
        2.2.5 突變病毒JS-RS的構(gòu)建
        2.2.6 缺失病毒體外生物學(xué)特性
    2.3 討論
第三章 PRV潛伏轉(zhuǎn)錄物相關(guān)分子表達特征研究
    3.1 材料與方法
        3.1.1 病毒、細胞與實驗動物
        3.1.2 引物設(shè)計
        3.1.3 提取病毒感染細胞后的總RNA
        3.1.4 DNaseⅠ消化過程
        3.1.5 反轉(zhuǎn)錄
        3.1.6 熒光定量RT-q PCR的構(gòu)建及優(yōu)化
        3.1.7 LLT和EP0基因在體外培養(yǎng)細胞中的動態(tài)表達特征
        3.1.8 拯救病毒EP0間接免疫熒光鑒定
        3.1.9 突變病毒感染體外培養(yǎng)細胞LLT分子的表達特征研究
        3.1.10 突變病毒感染小鼠神經(jīng)組織中LLT分子的表達特征研究
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 RT-q PCR的構(gòu)建及優(yōu)化
        3.2.2 病毒基因組對RT-q PCR方法的影響
        3.2.3 LLT分子在細胞中的動態(tài)表達情況
        3.2.4 IFA
        3.2.5 突變病毒在不同細胞中的LLT分子的表達情況
        3.2.6 小鼠三叉神經(jīng)組織中LLT分子的表達分析
    3.3 討論
第四章 TK基因缺失病毒株在大鼠上的致病力分析
    4.1 材料與方法
        4.1.1 病毒
        4.1.2 實驗動物
        4.1.3 試劑和設(shè)備
        4.1.4 引物設(shè)計
        4.1.5 gB基因的擴增
        4.1.6 連接轉(zhuǎn)化
        4.1.7 陽性質(zhì)粒的篩選和鑒定
        4.1.8 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        4.1.9 熒光定量PCR特異性試驗
        4.1.10 大鼠攻毒試驗
        4.1.11 提取動物組織中的DNA
        4.1.12 熒光定量檢測組織中g(shù)B基因的含量
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        4.2.3 SD大鼠滴鼻方式感染JS-2012
        4.2.5 SD大鼠肌肉注射方式感染JS-2012
        4.2.6 SD大鼠滴鼻方式感染JS2012-△TK
        4.2.7 SD大鼠肌肉注射方式感染JS2012-△TK
    4.3 討論
第五章 全文結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝
作者簡歷



本文編號：4048050