牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus）是一種單股正鏈RNA病毒,屬于黃病毒科、瘟病毒屬的成員,主要引起牛的呼吸道癥狀,腹瀉,黏膜糜爛,流產(chǎn)或產(chǎn)出先天缺陷的犢牛等癥狀,還能引起白細(xì)胞減少和免疫抑制。N^pro蛋白是ORF中編碼的第一種蛋白質(zhì),在瘟病毒屬中高度保守,具有蛋白酶活性,但目前尚不能完全解釋其蛋白水解作用及參與調(diào)控免疫抑制的機理。據(jù)報道BVDV N^pro蛋白通過蛋白酶體途徑降解IRF3,并且E1泛素激活酶起到了作用;轉(zhuǎn)錄因子ELF4可形成二聚體入核激活I(lǐng)型IFN啟動子,誘導(dǎo)I型IFN產(chǎn)生,并參與機體的抗病毒先天免疫反應(yīng)。我們前期研究證明:BVDV非結(jié)構(gòu)蛋白N^pro通過蛋白酶體途徑降解BoELF4,負(fù)調(diào)控I型干擾素的表達(dá);但是N^pro蛋白降解ELF4蛋白過程中的作用機制尚不完全清楚。由此,本研究探討了BVDV N^pro蛋白通過泛素化途徑降解ELF4的分子機制,以及篩選了與N^pro蛋白互作的蛋白,為深入了解N^pr...

【文章頁數(shù)】：85 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 引言
    1.2 牛病毒性腹瀉-粘膜病的研究進(jìn)展
        1.2.1 流行病學(xué)
        1.2.2 發(fā)病機理
        1.2.3 診斷
        1.2.4 病原學(xué)
        1.2.5 BVDV結(jié)構(gòu)與功能
        1.2.6 BVDV引起的免疫反應(yīng)
    1.3 天然免疫中的泛素化修飾
        1.3.1 泛素化修飾的簡介
        1.3.2 泛素化修飾參與調(diào)控抗病毒天然免疫
    1.4 轉(zhuǎn)錄因子ELF4
        1.4.1 ETS家族的簡介
        1.4.2 ELF4的功能
    1.5 熱休克蛋白Hsp70
        1.5.1 熱休克蛋白Hsp70的簡介
        1.5.2 Hsp70系統(tǒng)在病毒生命周期中的功能
    1.6 研究的目的及意義
2 牛病毒性腹瀉病毒N^pro真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
    2.1 材料
        2.1.1 載體、細(xì)胞和病毒
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
    2.2 方法
        2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與病毒增殖
        2.2.2 病毒及細(xì)胞的RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
        2.2.3 BVDV N^pro基因的克隆及分析
        2.2.4 BVDV N^pro蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.5 293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
        2.2.6 重組蛋白pcDNA3.1-N^pro Western blot的鑒定
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 BVDV NADL株接種MDBK細(xì)胞結(jié)果
        2.3.2 N^pro基因PCR的擴增
        2.3.3 重組質(zhì)粒p MD-18T-N^pro的鑒定
        2.3.4 BVDV N^pro蛋白生物信息學(xué)分析
        2.3.5 真核表達(dá)產(chǎn)物pcDNA3.1-N^pro的鑒定
        2.3.6 重組蛋白pcDNA3.1-N^pro的Western blot鑒定
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
3 BVDV非結(jié)構(gòu)蛋白N^pro通過K48位多聚泛素化降解ELF4
    3.1 材料
        3.1.1 細(xì)胞及質(zhì)粒
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
    3.2 方法
        3.2.1 蛋白互作的預(yù)測
        3.2.2 ELF4泛素化位點的預(yù)測
        3.2.3 轉(zhuǎn)化
        3.2.4 重組質(zhì)粒p3×flag-cmv-7.1-ELF4的鑒定
        3.2.5 重組蛋白p3×flag-cmv-7.1-ELF4的鑒定
        3.2.6 免疫共沉淀試驗
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 蛋白互作預(yù)測結(jié)果
        3.3.2 ELF4泛素化位點的預(yù)測及分布
        3.3.3 重組質(zhì)粒p3×flag-cmv-7.1-ELF4的鑒定
        3.3.4 ELF4蛋白Western blot的鑒定
        3.3.5 通過Co-IP試驗分析N^pro和ELF4的相互作用
        3.3.6 N^pro降解ELF4的K48位多聚泛素化
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
4 篩選BVDV N^pro互作蛋白及對ELF4的影響
    4.1 材料
        4.1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞、病毒
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器設(shè)備
    4.2 方法
        4.2.1 檢測N^pro在MDBK細(xì)胞中的表達(dá)
        4.2.2 BCA試劑盒檢測蛋白濃度
        4.2.3 快速銀染試驗
        4.2.4 免疫共沉淀試驗
        4.2.5 牛Hsp70基因引物的設(shè)計與合成
        4.2.6 牛Hsp70基因的擴增
        4.2.7 牛Hsp70基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.2.8 磷酸鈣沉淀轉(zhuǎn)染
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 N^pro質(zhì)粒在MDBK細(xì)胞中的表達(dá)情況
        4.3.2 Co-IP中N^pro蛋白總量的測定
        4.3.3 Co-IP試驗結(jié)果
        4.3.4 LC-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)鑒定SDS-PAGE膠中的所有蛋白
        4.3.5 候選蛋白分析結(jié)果
        4.3.6 牛源Hsp70基因的擴增
        4.3.7 真核表達(dá)產(chǎn)物pcDNA3.0-Hsp70雙酶切鑒定
        4.3.8 牛源Hsp70質(zhì)粒的表達(dá)
        4.3.9 BVDV N^pro蛋白與Hsp70的相互作用
        4.3.10 轉(zhuǎn)染Hsp70質(zhì)粒對BoELF4蛋白水平的影響
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄
個人簡歷



本文編號：4056186