研究背景和目的:骨肉瘤是最為常見的骨組織來源的惡性腫瘤,同時(shí)也是兒童惡性腫瘤的主要類型之一。其具有惡性程度高、生長(zhǎng)迅速、易發(fā)生侵襲及遷移等特點(diǎn),患者整體預(yù)后差,術(shù)后生存率低下。因此,有效的分子靶點(diǎn)對(duì)骨肉瘤的治療極其重要。ROCK2在腫瘤的進(jìn)展中扮演著重要角色,目前認(rèn)為其可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的收縮與粘附、侵襲及遷移、增殖和凋亡,然而其在骨肉瘤中的表達(dá)及影響機(jī)制并不清楚。在腫瘤的惡性進(jìn)展中糖酵解水平顯著提升,PFKFB3作為糖酵解及能量代謝的調(diào)節(jié)者,研究證實(shí)其在腫瘤的發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用,然而,PFKFB3在骨肉瘤中的作用及機(jī)制研究卻很少。本研究旨在探討骨肉瘤中ROCK2及PFKFB3的表達(dá)及相關(guān)性,進(jìn)一步深入探究其影響骨肉瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的機(jī)制。方法:1、免疫組化、熒光定量PCR及免疫印跡法分析ROCK2在骨肉瘤組織中的表達(dá)。2、篩選出下調(diào)效果最佳的shROCK2質(zhì)粒并下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中ROCK2的表達(dá),通過CCK8、EdU實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)能力的變化。然后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡比例變化。接下來通過劃痕愈合和Transwell實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響。最后我們利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shNC/U2-...

【文章頁(yè)數(shù)】：69 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
中英文縮略詞表
前言
第1章 骨肉瘤組織及細(xì)胞中ROCK2 的表達(dá)水平
    1.1 引言
    1.2 材料與方法
        1.2.1 材料
        1.2.2 RNA的提取及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)
        1.2.3 蛋白免疫印跡反應(yīng)(Western blot)
        1.2.4 HE染色
        1.2.5 免疫組織化學(xué)方法
        1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    1.3 結(jié)果
        1.3.1 骨肉瘤組織中ROCK2 的表達(dá)情況
        1.3.2 骨肉瘤細(xì)胞中ROCK2 的表達(dá)情況
    1.4 討論
    1.5 結(jié)論
第2章 ROCK2 蛋白對(duì)骨肉瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 材料
        2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.3 shROCK2 質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.4 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟
        2.2.5 Western blot
        2.2.6 CCK8 實(shí)驗(yàn)步驟
        2.2.7 EdU實(shí)驗(yàn)步驟
        2.2.8 流式細(xì)胞周期及凋亡
        2.2.9 Transwell實(shí)驗(yàn)
        2.2.10 劃痕實(shí)驗(yàn)
        2.2.11 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
        2.2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 ROCK2 最佳干擾質(zhì)粒的篩選
        2.3.2 CCK8及EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)降低ROCK2 表達(dá)后增殖能力影響
        2.3.3 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)降低ROCK2 表達(dá)后細(xì)胞的周期影響
        2.3.4 流式凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)降低ROCK2 表達(dá)后細(xì)胞的凋亡的影響
        2.3.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)降低ROCK2 表達(dá)后侵襲及遷移影響
        2.3.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)降低ROCK2 基因表達(dá)后遷移影響
        2.3.7 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)干擾ROCK2 表達(dá)細(xì)胞增殖能力的影響
        2.3.8 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)干擾ROCK2 表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)移能力的影響
    2.4 討論
    2.5 結(jié)論
第3章 ROCK2 調(diào)控骨肉瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移依賴于PFKFB3 的表達(dá)
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 材料
        3.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.3 質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.4 EdU實(shí)驗(yàn)步驟:
        3.2.5 Transwell:
        3.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn)步驟
        3.2.7 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟
        3.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 pcDNA3.1-(+)-ROCK2 質(zhì)粒的表達(dá)
        3.3.2 PFKFB3 在骨肉瘤組織中的表達(dá)
        3.3.3 骨肉瘤組織中ROCK2與PFKFB3 表達(dá)的相關(guān)性
        3.3.4 改變骨肉瘤細(xì)胞中ROCK2 表達(dá)后,PFKFB3 的表達(dá)情況
        3.3.5 PFKFB3是ROCK2 介導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子
    3.4 討論
    3.5 結(jié)論
第4章 ROCK2 抑制PFKFB3 泛素化進(jìn)而穩(wěn)定其表達(dá)
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 材料
        4.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
        4.2.3 Western blot實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.4 質(zhì)粒構(gòu)建
        4.2.5 免疫共沉淀(Co-IP)
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 PFKFB3 基因在骨肉瘤細(xì)胞中通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解
        4.3.2 ROCK2 抑制骨肉瘤細(xì)胞PFKFB3 泛素化降解
    4.4 討論
    4.5 結(jié)論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間研究成果
致謝
綜述
    參考文獻(xiàn)



本文編號(hào)：4050528